Paul Ehrlich a metylénová modrá: ako farbivo pomohlo formovať objavovanie liekov

Prínosom Paula Ehrlicha pre medicínu nebol liek. Bola ním úvaha o tom, ako sa na liek pozerať.

V roku 1878 predložil dizertačnú prácu, ktorej úvodná časť niesla názov „Chemické chápanie farbenia“. Tvrdil v nej, že farbenie tkanivového rezu a farbenie kusa látky sa riadia rovnakou logikou. V oboch prípadoch sa farba viaže vďaka chemickej afinite medzi farbivom a materiálom, nie preto, že tkanivo je nasiakavé, mastné alebo má tvar, ktorý zachytáva pigment. Ehrlich od detstva sledoval svojho bratranca, patológa Karla Weigerta, pri príprave farbených rezov. Jeho pozornosť však nepútali obrazy, ale skutočnosť, že farbivo si vyberalo, kam sa dostane.

Toto tvrdenie znie skromne. Nie je. Ak sa farbivo viaže na tkanivo z chemických dôvodov, potom vzor zafarbenia vypovedá o chémii daného tkaniva. Farbený preparát prestáva byť ilustráciou a stáva sa meraním.

Hneď na tom začal stavať. V roku 1880 skombinoval metylénovú modrú s kyslým fuchsínom a zmes nazval neutrálnym farbivom, neutralen Farbkörper. Dokázala rozlíšiť jednotlivé druhy bielych krviniek tam, kde vtedy používané samostatné farbivá nestačili. O dva roky neskôr predstavil metódu farbenia tuberkulóznych bacilov metylovou violeťou a Koch tento postup prevzal do vlastnej práce.

Teória, ktorá neskôr poskytla týmto postupom spoločný základ, je samostatnou témou a jej časové zaradenie sa bežne zjednodušuje. Ehrlichova teória bočných reťazcov, podľa ktorej látka pôsobí na bunku preto, že sú chemicky kompatibilné, patrí do 1890s, nie do rokov jeho experimentov s farbivami. Skoršia práca priniesla predchádzajúce presvedčenie: selektivita má chemický základ, a preto ju možno cielene hľadať, nie na ňu iba náhodou natrafiť.

Experiment, ktorý premenil farbivo na mapu

V roku 1885 Ehrlich vydal monografiu o potrebe kyslíka v organizme s podtitulom označujúcim ju za farebno-analytickú štúdiu. Jej metóda spočívala v injekčnom podávaní farbív, ktorých farba závisí od oxidačného stavu, a následnom porovnávaní toho, ako ich rôzne orgány redukujú alebo zachovávajú. Farbivo slúžilo ako nástroj, podobne ako teplomer: vypovedalo o podmienkach v tkanive, ktoré nebolo možné skúmať priamo. Ehrlich sám formuloval cieľ ako určenie redukčnej schopnosti živých orgánov pomocou konkrétnych farbív.

Výsledok s metylénovou modrou prišiel v roku 1886 v článku o reakcii farbiva so živou nervovou hmotou, ktorý predniesol lekárskej spoločnosti v decembri predchádzajúceho roka. Metylénovú modrú zaviedli do krvného obehu živého zvieraťa a potom odobrali tenké rezy tkaniva a vystavili ich vzduchu, aby sa nahromadené bezfarebné farbivo oxidovalo späť na modré a ukázalo, kde sa sústredilo. Nervové bunky a nervové vlákna sa zafarbili, a to natoľko selektívne, že sa táto technika stala štandardnou metódou zobrazovania nervového tkaniva. Zlúčenina už nebola iba farbivom naneseným na mŕtvy rez na laboratórnom stole. Bola značkou, ktorá sa sama rozmiestňovala v živom tele a ktorej rozloženie sa dalo čítať.

Vlastnosť, na ktorej stáli oba experimenty, treba pomenovať jasne, pretože od nej závisí všetko ostatné v tomto príbehu. Premeny metylénovej modrej sú vratné. Jej redukovaná forma, leukometylénová modrá, je bezfarebná a pri kontakte s kyslíkom sa vracia do podoby modrého katiónu. Roztok farbiva s glukózou v uzavretej nádobe je bezfarebný; po otvorení nádoby zmodrie. Podľa dostupných správ Ehrlich tento jav priamo ukázal tým, že na farbené rezy pôsobil chloridom železa aj vzduchom a sledoval návrat farby. Farbivo, ktoré mení farbu podľa redoxného stavu svojho okolia, slúži ako sonda tohto okolia.

Vedľa seba teda stáli dve vlastnosti. Farbivo dokázalo rozlíšiť jedno tkanivo od druhého. A zmenou oxidačného stavu sa dalo zapínať a vypínať.

Pri spätnom pohľade je druhá vlastnosť začiatkom chemoterapie. Ak sa zlúčenina viaže na jeden druh tkaniva, ale na iný nie, potom by tá istá zlúčenina mohla zasiahnuť jeden druh organizmu, ale iný nie. Ehrlich tento záver vyslovil priamo: ak sa patogén dá selektívne zafarbiť, zafarbenie by mohlo naznačovať špecifické poškodenie tohto patogénu. Farbivo by sa teda mohlo použiť ako liek zameraný na votrelca, nie na pacienta.

Prvý test u pacienta sa netýkal malárie. V roku 1890 Ehrlich spolu s psychiatrom Arthurom Leppmannom uviedli, že metylénová modrá zmierňuje bolesť pri neuralgických a reumatických ťažkostiach svalov, kĺbov a šliach. Obaja diskutovali o tom, či by liek mohol pôsobiť na duševné ochorenia, a rozhodli sa ho neskúšať. Taliansky lekár Pietro Bodoni z Janova to napriek tomu urobil. Názov jeho článku z roku 1899 odkazuje na sedatívne pôsobenie pri rôznych formách psychózy: opísal upokojenie štrnástich rozrušených pacientov a poznamenal, že iní janovskí lekári už farbivo používali na rovnaký účel. Sedácia nie je pôsobenie na samotné ochorenie a toto rozlíšenie sa v tejto histórii opakovane vracia.

Práca s maláriou prišla v roku 1891 v spolupráci s patológom Paulom Guttmannom v berlínskej nemocnici Moabit. Metylénovú modrú podali dvom pacientom a správa vyšla v Berliner klinische Wochenschrift z 28. septembra 1891. V prvom prípade pacient večer 29. júna užil naraz 0.5 g farbiva; očakávaný záchvat sa naplno nerozvinul a jedinou následne zaznamenanou ťažkosťou bola mierna strangúria s modrým močom. Horúčkové záchvaty v prvých dňoch vymizli a parazity zmizli z krvi najneskôr do ôsmeho dňa. Autori sami zhrnuli, že ich očakávania sa úplne naplnili. Dva prípady bez kontrolnej skupiny však nie sú dôkazom. Podrobnejší opis metylénovej modrej a malárie, vrátane moderných skúšaní, patrí na samostatnú stránku. Zaujímavá otázka je tu užšia: koľko z Ehrlichovej úvahy obstálo pri stretnutí s parazitom.

Kde úvaha obstála a kde zlyhala

Z mechanizmu veľa neobstálo, aspoň nie v podobe, ktorú Ehrlich navrhol. Jednoduchá verzia, v ktorej sa plochý tricyklický katión zasúva medzi páry báz DNA parazita, pri rode Plasmodium neobstojí. Infikovaná červená krvinka redukuje metylénovú modrú tak ľahko, že sa k parazitovi vôbec nedostane ako planárny katión. Vysvetlenie interkaláciou, ktoré sedí na akridínové farbivá, preto na toto farbivo nesedí.

To, čo dôkazy podporujú, je menej jednoznačné. Metylénová modrá inhibuje glutatiónreduktázu parazita pri koncentráciách, ktoré možno dosiahnuť u pacienta. Blokuje premenu hému na hemozoín, inertný pigment, ktorý parazit vytvára, aby sa neotrávil vlastným trávením hemoglobínu, približne rovnako účinne ako chlorochín a oveľa účinnejšie ako chinín. Jej redoxné cyklovanie navyše vytvára reaktívne formy kyslíka v bunke, ktorá ich už produkuje. Ktorý z týchto dejov je skutočným mechanizmom, alebo či prispievajú všetky, stále nie je vyriešené.

Je tu aj ďalšia komplikácia, ktorá by mala ovplyvniť čítanie každého historického tvrdenia o tejto zlúčenine. Komerčná metylénová modrá z daného obdobia nebola jedinou látkou. Vzorky obsahovali Azure B, monodemetylovaný kongenér, a v starších roztokoch sa ho hromadilo viac. Azure B je metachromatické farbivo s odlišnými cieľmi: dvojvláknovú DNA farbí na tmavomodro a RNA na zeleno. Zmes dvoch farbív s odlišným rozložením, v pomeroch, ktoré nikto nezaznamenal, nemôže podoprieť jednoznačné tvrdenie o tom, čo v nej robila metylénová modrá.

Samotné farbivo chinín nikdy nevytlačilo. Metóda uspela lepšie. Ehrlichov žiak Wilhelm Roehl, ktorý pracoval pre farbiarsky a farmaceutický koncern IG Farben, ďalej presadzoval deriváty farbív ako lieky na tropické ochorenia a poskytol chýbajúci nástroj: kanárika infikovaného vtáčou maláriou ako bežný model na skríning kandidátskych zlúčenín. Werner Schulemann potom upravil bočný reťazec a výsledná fenotiazíniová soľ vyliečila experimentálnu infekciu. Pacientov však stále farbila namodro.

Trvalým výsledkom sa napokon nestalo ani farbivo, ani kruhový systém, ale bočný reťazec. Pridanie dialkylaminoalkylaminoskupiny zmenilo správanie molekuly a tento fragment prežil každú neskoršiu prestavbu. Ak sa táto skupina zachová a fenotiazíniový kruh sa vymení za akridínový, výsledkom je chinakrín. Ak sa nahradí chinolínovým, výsledkom je chlorochín. Pamachín, primachín a amodiachín, ktoré sú stále súčasťou zoznamu antimalarík, nesú rovnakú skupinu. Zlúčenina, ktorá ako liečba zlyhala, poskytla časť, ktorá uspela.

Súvislosť s antipsychotikami vedie cez kruh, nie cez liek. Práve objasnenie štruktúry metylénovej modrej priviedlo Heinricha Augusta Bernthsena v roku 1883 k základnému fenotiazínovému jadru. S touto kostrou, rôzne substituovanou, pracovali chemici v Rhône-Poulenc v 1940s pri hľadaní antihistaminík. Jedna z týchto zlúčenín bola syntetizovaná približne koncom roka 1950 a testoval ju chirurg Henri Laborit, ktorý si všimol, že pacienti po nej zostávali pokojní a ľahostajní. Jej prvé publikované psychiatrické použitie u pacienta s mániou prišlo v januári 1952. Prvé antipsychotikum nie je ani tak potomkom Ehrlichovho antimalarika, ako skôr vzdialeným príbuzným farbiva, s ktorým začal.

Tri návyky, ktoré sa oplatí z tejto epizódy zachovať

1. „Prvý syntetický liek používaný v medicíne“ označuje kategóriu a výhrady sú rozsiahlejšie, než táto fráza naznačuje. Táto formulácia sa ustálila; často citovaný prehľad Schirmera a kolegov v časopise Neurobiology of Aging označuje metylénovú modrú za vôbec prvý plne syntetický liek používaný v medicíne. Chloralhydrát bol zavedený ako syntetické sedatívum v roku 1869, teda o viac ako dvadsať rokov skôr. Časť odpovede poskytuje samotný článok z roku 1891, pretože jeho autori vymenúvajú syntetické antipyretiká, ktoré už proti malárii zlyhali, medzi nimi chinolín, antipyrín a antifebrín. Ehrlichov vlastný arzénový prípravok na syfilis prišiel ešte neskôr. Obhájiteľná verzia tvrdenia sa týka skôr metódy než prvenstva: metylénová modrá patrí medzi najskoršie syntetické zlúčeniny vybrané na pôsobenie proti konkrétnemu organizmu na základe chemickej teórie selektivity.
2. Selektívne rozloženie neznamená selektívny prínos. Ehrlichov výsledok z roku 1886 ukázal, že farbivo sa dostáva do nervového tkaniva. Kam sa zlúčenina dostáva a čo po príchode robí, sú dve rôzne merania, pričom prvé je oveľa jednoduchšie. Práve v tejto medzere odvtedy žije väčšina tvrdení o metylénovej modrej a mozgu.
3. Čistota patrí k dôkazom, nie k marketingu. Historické záznamy sú nejednoznačné práve z tohto dôvodu. Malé štruktúrne rozdiely menia to, kam sa táto zlúčenina dostáva. Preto musí byť certifikát analýzy naviazaný na konkrétnu šaržu, nie ponúkaný ako všeobecné vyhlásenie, že výrobok bol testovaný. Predajca, ktorý tvrdí zhodu s liekopisnou monografiou, no testuje iba ťažké kovy, tvrdí viac, než správa podporuje. Blupreme získava metylénovú modrú od farmaceutického výrobcu a testuje celú špecifikáciu stanovenú monografiou: identitu, čistotu, organické nečistoty, zvyškové rozpúšťadlá, prvkové nečistoty, zvyšok po žíhaní, mikrobiálne limity a bakteriálne endotoxíny. Správa je zverejnená pri výrobku a stránka o metylénovej modrej kvality USP vysvetľuje tieto limity aj to, prečo treba ako prvý hľadať výsledok pre Azure B.

Chronologický prehľad prameňov

Chronologická postupnosť míľnikov vrátane chémie farbív, ktorá Ehrlichovi predchádzala, a kvalitatívnych tried a špecifikácií, ktoré prišli po ňom, je samostatne uvedená v histórii metylénovej modrej. Samotnú identitu zlúčeniny opisuje článok o tom, čo je metylénová modrá.

Obrazové podklady k tomuto opisu, reprodukované v prehľade Kraftsovej, Hempelmannovej a Skórskej-Staniovej z roku 2012, nie sú rovnocenné a jeden príklad ukazuje prečo. Obrazová tabuľa z roku 1891 je primárnym záznamom skúšania; portrét z roku 1910 vedľa nej datuje povesť a nič viac. Stránky z Andersagovho zápisníka z roku 1934 sú priamou stopou chinolínovej substitúcie, zapísanou vlastnou rukou chemika.

Poctivé zhrnutie Ehrlichových experimentov s farbivami je, že správne vystihol selektivitu aj cieľ, no mýlil sa v mechanizme. Metylénová modrá sa skutočne koncentruje v nervovom tkanive a skutočne poškodzuje parazita malárie. To druhé však nerobí kvôli tomu prvému a chemické vysvetlenie, ktoré ponúkol pre oba javy, bolo nesprávne. To, čo nesporne preukázal, bolo trvalejšie než správny mechanizmus: zlúčeninu možno vybrať, nie iba nájsť, a vybrať ju na základe dôkazov získaných ešte predtým, než ju niekto podá pacientovi.