Ako metylénová modrá vstupuje do buniek: redukcia, reoxidácia a rozdeľovanie medzi membránu a prostredie

Keď sledujete, ako endotelové bunky v kultivačnej miske prijímajú metylénovú modrú, zjavné vysvetlenie je zároveň nesprávne. Médium stráca modrú farbu a v bunkách pribúdajú modré granuly, takže farbivo muselo prejsť cez membránu ako modrá molekula. Experimenty však hovoria niečo iné. Modrá forma prechádza len veľmi slabo. Prechádza bezfarebná forma a modré sfarbenie, ktoré vidíte vnútri, vzniká až v bunke, po jej vstupe.

Tento obrátený pohľad je dôležitý, pretože určuje, čo vám sfarbenie môže a nemôže povedať. Modré granuly poukazujú na oxidované farbivo, ktoré sa reoxidovalo a zachytilo v organelách. Nevyjadrujú celkové množstvo farbiva v bunke, nevyjadrujú zásobu redukovanej formy a nemerajú biologický účinok. Aby bolo jasné prečo, sledujte tri kroky: redukciu na povrchu, difúziu redukovanej formy a reoxidáciu so zachytávaním vnútri.

Obe formy sa správajú ako rozdielne molekuly

Oxidovaná metylénová modrá má plochý, kladne nabitý kruhový systém. Rozpúšťa sa vo vode, silno absorbuje svetlo v oblasti približne 600 až 700 nanometrov a vyzerá modro. Kľúčový je náboj. Nabitá molekula s afinitou k vode neprechádza lipidovou membránou ľahko, preto sa v literatúre opatrne označuje ako relatívne nepriepustná cez membránu, nie úplne nepriepustná.

Redukovaná metylénová modrá, nazývaná leukometylénová modrá, je bezfarebná, bez náboja a rozpustná v tukoch. Keď sa odstráni náboj, membrána prestane byť bariérou. Redukovaná molekula ľahko difunduje cez membránu a po vstupe do kompartmentu s viac oxidujúcim prostredím môže opäť stratiť elektróny a vrátiť sa do modrej, nabitej formy, ktorá zostáva zachytená. Redoxná chémia farbiva je teda zároveň jeho transportným mechanizmom. Zmena počtu elektrónov mení aj priepustnosť.

Elektróny pre prvý krok poskytuje samotná bunka. Bunky cicavcov prenášajú elektróny cez plazmatickú membránu a presúvajú redukčné ekvivalenty od vnútrobunkových donorov smerom von k akceptorom na povrchu. Táto aktivita naprieč plazmatickou membránou je bežnou bunkovou funkciou, prítomnou vo väčšine typov buniek. Povrchová reduktáza endotelových buniek, ktorá spracúva tiazínové farbivá, sa pritom v jednom výpovednom ohľade správa ako ostatné: pokračuje v činnosti aj v prítomnosti kyanidu a azidu v dávkach, ktoré zastavujú neskoršie kroky. Práve toto oddelenie procesov je kľúčom k celému vysvetleniu.

Najprv sa skúmalo rozdeľovanie medzi fázy, ktoré takmer vysvetlilo príjem

V roku 1929 si Marian Irwin z Rockefellerovho inštitútu položila jednoduchšiu otázku. Možno je vstup farbiva len výsledkom jeho rozdeľovania medzi vodu a tukové vrstvy bunky a v laboratóriu môže tieto tukové vrstvy zastúpiť vrstva chloroformu. Vo svojich spektrofotometrických štúdiách prenikania pretrepávala vodné roztoky farbív s chloroformom a porovnávala, čo prešlo do organickej fázy, s tým, čo vstúpilo do živých buniek rias.

Dva výsledky tejto práce si stále zaslúžia pozornosť. Po prvé, komerčné roztoky metylénovej modrej obsahovali trimetylt ionín, dnes nazývaný Azure B, a táto nečistota prenikala rýchlejšie než samotná metylénová modrá, najmä pri zásaditom pH, keď prevláda forma voľnej bázy rozpustná v lipidoch. Časť zdanlivého vstupu metylénovej modrej bola v skutočnosti selektívnym vstupom Azure B. Po druhé, pH určovalo výsledok tým, že určovalo ionizačný stav, a poškodené bunky prijímali oveľa viac farbiva než neporušené. Rozdeľovacie koeficienty a nábojový stav riadili, čo absorboval umelý systém aj živá bunka, a podobnosť medzi nimi podporovala predstavu nevodných vrstiev na hranici bunky.

Model bol predvídavý, pokiaľ išlo o lipidy a ionizáciu, no nedokázal rozlíšiť farbivo, ktoré sa rozdeľuje medzi fázy v nezmenenej forme, od farbiva, ktoré sa na povrchu chemicky premení, prejde v inej podobe a vnútri sa premení späť. Toto rozlíšenie si vyžadovalo iný experiment, ktorý prišiel o sedemdesiat rokov neskôr pri skúmaní pľúcneho endotelu.

Redukcia vonku, zachytávanie vnútri

Merker a jeho kolegovia pracovali s kultivovanými endotelovými bunkami hovädzej pľúcnej tepny a navrhli trojkrokovú postupnosť: oxidované farbivo sa na povrchu bunky redukuje na bezfarebnú lipofilnú formu, redukovaná forma difunduje dovnútra a vnútrobunková reoxidácia obnovuje oxidovanú formu nepriepustnú cez membránu, ktorá sa hromadí. Ich štúdia príjmu tiazínových farbív endotelovými bunkami následne overovala túto postupnosť tým, že sa ju pokúšala prerušiť na konkrétnych miestach.

Prvým nástrojom bol ferrikyanid, akceptor elektrónov, ktorý nemôže vstúpiť do bunky. Keď povrchové enzýmy redukujú modré farbivo na jeho bezfarebnú formu mimo bunky, ferrikyanid môže tieto elektróny odobrať späť a obnoviť modré farbivo v médiu ešte predtým, než prejde cez membránu. Kým bol ferrikyanid prítomný v nadbytku (10 mikromolárne farbivo oproti 50 až 500 mikromolárnemu ferrikyanidu), príjem farbiva sa takmer zastavil. Až po spotrebovaní ferrikyanidu sa obnovil bežnou rýchlosťou. Kinetika poskytla rovnaké vysvetlenie aj druhým spôsobom. Ferrikyanid ubúdal približne konštantnou rýchlosťou, čo zodpovedalo stálemu toku povrchovej redukcie zásobujúcemu opakovane využívaný mediátor, zatiaľ čo extracelulárne farbivo ubúdalo exponenciálne s vyčerpávaním jeho zásoby. Konštantný tok spolu s ubúdajúcou zásobou znamená, že signál ferrikyanidu vypovedá o nepretržitej redukcii, nie o molekulách farbiva opúšťajúcich roztok.

Druhý nástroj úplne odstránil krok prechodu cez membránu. Výskumníci naviazali toluidínovú modrú O, blízko príbuzné tiazínové farbivo, na veľký polyakrylamidový reťazec, ktorý bol príliš veľký na vstup do bunky v ktoromkoľvek oxidačnom stave. Bunky napriek tomu redukovali naviazané farbivo. Redukcia teda nevyžaduje prístup do vnútra bunky. Príslušný mechanizmus je prístupný na povrchu alebo je s ním elektricky prepojený.

Potom prišlo oddelenie procesov, ktoré dalo článku názov. Kyanid a azid v koncentrácii 2 milimolárne výrazne potlačili hromadenie farbiva a pod mikroskopom takmer zmizli tmavomodré a fialové inklúzie, ktoré bežne obklopujú jadro. Ani jeden inhibítor však nespomalil extracelulárnu redukciu: cyklovanie ferrikyanidu pokračovalo bez oslabenia a neprenikajúci polymér sa naďalej redukoval. Blokáda sa nachádzala v neskoršom kroku. Kyanid a azid zastavovali vnútrobunkovú reoxidáciu a sekvestráciu, nie povrchovú redukciu. Kontroly životaschopnosti podporili tento výklad, pretože bunky si počas týchto zásahov zachovali svoj cytosolový markerový enzým laktátdehydrogenázu. Strata príjmu teda nebola len dôsledkom otravy alebo porušenia membrány.

Jedno upozornenie z tejto práce platí dodnes. Modré inklúzie sa nachádzali okolo jadra, nie v ňom, čo zodpovedá oxidácii v subcelulárnych organelách, no štúdia neurčila, o ktoré organely išlo. Podobné vzorce v iných typoch buniek sa na základe slabých dôkazov označovali za lyzozomálne. Zachytávanie preto považujte za preukázané, ale jeho presné miesto za predbežné. Čitatelia, ktorí sledujú ďalšiu dráhu elektrónov, môžu pokračovať témou mitochondriálneho transportu elektrónov a redoxných procesov a širším pohľadom na absorpciu a distribúciu podľa cesty podania.

Sfarbenie nie je expozícia

Tretia štúdia ukazuje, čo sa stane, keď sa tento mechanizmus príjmu stretne s meraním biologickej odpovede. Scott a jeho kolegovia zistili, že metyl-beta-cyklodextrín, cukor v tvare prstencového toroidu, priamo viaže metylénovú modrú. Asociačná konštanta inklúzneho komplexu je približne 310 na molárnu jednotku oproti približne 5846 na molárnu jednotku pri dimerizácii farbiva. Vo fibroblastoch L929 táto väzba zablokovala sfarbenie buniek aj stimuláciu príjmu glukózy: predinkubácia s cyklodextrínom zabránila modrému sfarbeniu a jeho neskoršie pridanie urýchlilo odfarbovanie. Keď sa optický modrý signál z buniek strácal, aktivovaný transport glukózy súbežne slabol.

Autori túto koreláciu interpretovali ako podporu priamej interakcie medzi farbivom a proteínom v dráhe aktivácie glukózového transportéra skôr než mechanizmu dlhodobo pretrvávajúceho oxidačného stresu. Tento záver je rozumný, má však svoje hranice. Experiment neurčuje daný proteín, nepreukazuje väzbu na samotný transportér a korelácia medzi odfarbovaním a stratou účinku nemôže vylúčiť všetky dráhy sprostredkované redoxnými procesmi.

Trvalé poučenie sa týka merania. Optické sfarbenie zachytáva viditeľné, oxidované farbivo spojené s bunkou. Bezfarebnú redukovanú zásobu úplne prehliada, takže aj slabo sfarbená bunka môže stále obsahovať ekvivalenty farbiva. Intenzívne sfarbená bunka zase poukazuje na zachytené oxidované farbivo, nie na celkovú expozíciu tkaniva alebo veľkosť účinku. Rovnaké upozornenie platí aj vo väčšom meradle: porovnávanie sfarbenia medzi typmi buniek alebo považovanie tmavého tkanivového rezu za dôkaz vyššej expozície opakuje pôvodný omyl pri pozorovaní kultivačnej misky. Príjem je cyklus redukcie, difúzie a reoxidácie a každý jednotlivý snímok modrej formy zachytáva len jednu jeho časť. Praktické dôsledky pre laboratórne farbenie a manipuláciu aj pre interpretáciu tvrdení o dávke a expozícii z toho vyplývajú priamo.