Prečo sa absorpcia metylénovej modrej mení s koncentráciou

Vezmite jednu fľašu zásobného roztoku metylénovej modrej a nalejte z nej do dvoch pohárov. Prvý naplňte zásobným roztokom a druhý jeho desaťnásobným zriedením. Druhý pohár je podľa očakávania bledší. Pozrite sa pozorne a všimnete si ešte jednu zmenu. Zmenil sa odtieň. Jeden roztok má skôr čistú nebeskú modrú farbu a druhý modrú s fialovým nádychom. Riedenie neznížilo len intenzitu. Zmenilo aj to, ktorá chemická forma sa najviac podieľa na absorpcii.

Princíp tejto zmeny je jednoduchý. Rozpustená metylénová modrá nie je jedinou chemickou formou. Samostatný katión farbiva, nazývaný monomér, sa môže uložiť plochou oproti druhému katiónu a vytvoriť dimér. Diméry sa môžu spájať do väčších agregátov. Každá forma má vlastné absorpčné spektrum. Spektrofotometer zaznamenáva súčet príspevkov zmesi prítomnej v danej kyvete za daných podmienok. Zmeňte zmes a spektrum sa zmení, aj keď sa celkový obsah farbiva mení presne podľa pomeru riedenia.

Monomér a dimér absorbujú odlišne

Predstavte si monomér ako plochú kartu s kladným nábojom rozloženým po jej kruhovom systéme. Dve takéto karty môžu ležať plochami oproti sebe. Kladné náboje sa odpudzujú, ale ploché aromatické povrchy sa priťahujú prostredníctvom interakcií pri vrstvení a okolitá voda s protiiónmi tienia odpudzovanie. Výsledkom je viazaná dvojica so spoločnými elektrónovými stavmi. Jej dovolené prechody majú vyššiu energiu než prechod monoméru, takže pás diméru sa objavuje pri kratšej vlnovej dĺžke než pás monoméru. Väčšie agregáty prispievajú ešte ďalej smerom k modrej oblasti vo forme ramena pásu.

Pri veľmi nízkej koncentrácii v čistej vode prevládajú monoméry a dominuje pás pri dlhšej vlnovej dĺžke. S rastúcou celkovou koncentráciou sa zvyšuje podiel párovej formy a pás pri kratšej vlnovej dĺžke rastie vzhľadom na prvý pás. Pomer týchto dvoch pásov preto vypovedá o zložení zmesi, nie priamo o celkovej koncentrácii. Meranie pri jedinej vlnovej dĺžke ich nedokáže rozlíšiť bez predpokladu o tom, ktorá forma je prítomná.

Preto musia byť referenčné spektrá vždy uvedené spolu s podmienkami. Spektrálny prehľad metylénovej modrej uvádza polohy pásov spolu s rozpúšťadlom, soľným zložením, pH, teplotou a rozsahom koncentrácií, pri ktorých boli získané. Ak uvediete polohu maxima bez týchto podmienok, údaj nie je dostatočne špecifikovaný. Dve laboratóriá môžu správne uvádzať rozdielne spektrá toho istého farbiva, pretože merali rozdielne zmesi.

Čo posúva rovnováhu

Koncentrácia je hlavný faktor. Na vznik diméru sa musia stretnúť dva monoméry, preto jeho podiel rastie s celkovou koncentráciou farbiva rýchlejšie než lineárne. Uvádzané dimerizačné konštanty vo vode sa pri teplotách blízkych izbovej teplote pohybujú v tisícoch na molárnu jednotku, takže podiel diméru v mikromolárnom rozsahu prudko rastie. Široké globálne prispôsobenie modelu údajom od mikromolárnych po milimolárne koncentrácie farbiva zistilo nenulový príspevok tetraméru už pod 34 mikromolárnou koncentráciou. To upozorňuje, že pri desiatkach mikromolov nemožno bezvýhradne dôverovať modelu s presne dvoma formami. Presné podiely závisia od prostredia, preto tento článok uvádza smery zmien, nie univerzálnu prepočtovú tabuľku.

Soľ je druhý faktor. Rozpustené ióny tienia odpudzovanie medzi dvoma katiónmi, takže pridaný chlorid sodný a podobné elektrolyty posúvajú zmes smerom k dimérom a agregátom pri rovnakej koncentrácii farbiva. Tento účinok je viditeľný v štúdiách agregácie metylénovej modrej v soľných a vodných prostrediach, v ktorých sa meralo farbivo s koncentráciou približne od 1 mikromolárnej do 3.4 milimolárnej pri koncentráciách chloridu sodného od 0 do 0.15 molárnej. V tomto modeli dosiahol podiel tetraméru približne 0.93 v oblasti s vysokou koncentráciou farbiva aj soli. Spektrum zaznamenané vo vode a spektrum zaznamenané vo fyziologickom roztoku preto nie sú zameniteľné štandardy.

Teplota pôsobí opačným smerom. Pri vrstvení sa uvoľňuje viazaná voda a tepelný pohyb mu odporuje, takže zahrievanie roztoku zvyčajne vedie k disociácii časti dimérov späť na monoméry, zatiaľ čo ochladzovanie podporuje asociáciu. Disociačná entalpia získaná prispôsobením modelu je záporná, približne mínus 30 kilojoulov na mol v rozsahu 282 až 333 kelvinov, čo potvrdzuje exotermickú asociáciu. Studená vzorka meraná ihneď po vybratí z chladničky môže vykazovať vyššiu mieru agregácie než tá istá vzorka po ustálení na izbovú teplotu.

Rozpúšťadlo určuje východiskové podmienky. Voda svojím silným hydrofóbnym účinkom podporuje vrstvenie plochých katiónov farbiva. Alkoholy, ako etanol a metanol, lepšie solvatujú kruhy a rozrušujú agregáty, takže pri rovnakej koncentrácii farbiva je v etanole vyšší podiel monoméru než vo vode. Podobne pôsobia aprotické spolurozpúšťadlá: v zmesiach vody a DMSO pri 293 kelvinoch pridané DMSO potláčalo dimerizáciu, čo poukazuje na štruktúru vody ako hnaciu silu vrstvenia. Pri tenzidoch treba brať do úvahy oba smery účinku. Nad kritickou micelárnou koncentráciou môžu micely solubilizovať jednotlivé monoméry a obnoviť spektrum podobné monoméru. Pod touto hranicou môže tenzid s opačným nábojom naopak podporovať vrstvenie: pri 100 mikromolárnej koncentrácii farbiva dosiahla polymerizácia vyvolaná SDS maximum približne pri 4 milimolárnej koncentrácii SDS, čo je zhruba polovica kritickej micelárnej koncentrácie, pred následným prerozdelením pri vyšších koncentráciách tenzidu. Práca o vplyve rozpúšťadla a organizovaných prostredí na spektrá metylénovej modrej ukazuje, ako výrazne pozorované pásy určuje bezprostredné molekulové okolie, nielen celková koncentrácia.

pH je dôležité najmä pri krajných hodnotách. V rozsahu blízkom neutrálnemu pH, ktorý sa používa pri väčšine laboratórnych prác, zostáva metylénová modrá vo svojej známej modrej katiónovej forme a spektrálne zmeny určuje predovšetkým agregácia. Silná kyselina alebo zásada, redoxné reakcie vytvárajúce bezfarebnú leukoformu či väzba na proteíny a častice pridávajú ďalšie stavy nad rámec dvojice monomér–dimér. Ak sa spektrum zmení po pridaní pufra, skontrolujte jeho obsah solí a zložiek schopných väzby skôr, než všetko pripíšete samotnému pH. Prehľad chémie a protonácie oddeľuje tieto otázky chemickej identity od otázky agregácie, ktorej sa venuje tento článok.

Prečo sa priamka Beerovho-Lambertovho zákona zakrivuje

Beerov-Lambertov zákon hovorí, že absorbancia sa rovná súčinu absorptivity, koncentrácie a dĺžky optickej dráhy. Je to zákon založený na počte absorbujúcich častíc. Predpokladá, že počítané objekty zostávajú rovnaké, aj keď sa mení ich počet: jedna absorbujúca forma, nemenné spektrum, žiadne chemické zmeny s koncentráciou, monochromatické meracie svetlo, žiadny rozptyl ani opätovné vyžarovanie a svetlo, ktoré skutočne prechádza uvedenou dráhou.

Agregácia porušuje prvý predpoklad. Formálne zostáva celková absorbancia súčtom príspevkov jednotlivých foriem: dĺžka optickej dráhy krát absorptivita každej formy krát jej vlastná koncentrácia. Každá forma sa riadi týmto zákonom. Zmes nie, pretože koncentrácie jednotlivých foriem sú nelineárnymi funkciami celkovej koncentrácie farbiva. Kalibračná krivka absorbancie v páse monoméru v závislosti od celkovej koncentrácie farbiva preto začína pri nízkych koncentráciách ako priamka a s rastúcou koncentráciou sa zakrivuje nadol, pretože každý ďalší prírastok prináša pomerne menej monoméru. Krivka meraná v páse diméru sa zakrivuje opačným smerom. Práce o agregácii označujú práve tento mechanizmus za zdroj pozorovaných odchýlok od Lambertovho-Beerovho zákona. Bežnou chybou je preložiť zakrivenou oblasťou priamku a extrapolovať ju. Priamka platí iba v rozsahu a matrici, pre ktoré bola vytvorená.

Riedenie vytvára podobnú pascu. Zriedenie koncentrovaného zásobného roztoku do rozsahu prístroja nezachováva pomer jednotlivých foriem. V zriedenom roztoku v kyvete sa rovnováha znovu ustáli smerom k monoméru, takže jeho spektrum správne opisuje zriedenú vzorku, ale nesprávne opisuje zásobný roztok. Spätný výpočet spektra zásobného roztoku násobením absorbancií obnoví odhad celkového obsahu iba vtedy, ak kalibrácia už zohľadňuje tento posun. Pôvodný tvar pásov neobnoví nikdy. Každý, kto porovnáva spektrum koncentrátu so zriedenou referenciou, porovnáva dve rozdielne zmesi.

Dĺžka optickej dráhy je súčasťou výsledku

Absorbancia rastie úmerne vzdialenosti, ktorú svetlo prejde vzorkou. Kyveta s dĺžkou optickej dráhy 10 mm poskytuje desaťnásobnú absorbanciu oproti kyvete s dráhou 1 mm naplnenej tým istým roztokom. Táto úmernosť platí presne iba pre ten istý roztok a pri agregácii je táto podmienka zásadná.

V praxi je dĺžka optickej dráhy nástrojom na udržanie merania v platnom rozsahu. Dlhá dráha poskytuje citlivosť pri zriedených, prevažne monomérnych roztokoch. Krátka dráha udrží koncentrovanú vzorku v rozsahu merania bez výrazného riedenia, ktoré by znovu nastavilo rovnováhu. Výskum agregácie, z ktorého pochádzajú vyššie uvedené hodnoty, postupoval presne takto: kyvety s dráhou 1 centimeter pre koncentrácie farbiva od 1.1 do 34 mikromolárnej a kyvety s dráhou 0.01 centimetra pre koncentrácie od 94 mikromolárnej do 3.4 milimolárnej. Mikroobjemové meracie podstavce a čítačky mikrotitračných doštičiek prinášajú vlastnú geometriu s krátkymi a niekedy premenlivými dráhami, ako aj povrchmi, na ktorých sa môže katiónové farbivo adsorbovať. S hodnotou uvádzajte aj dĺžku optickej dráhy, rovnako ako spektrálny prehľad uvádza rozpúšťadlo a soľ. Absorbancia bez dĺžky optickej dráhy nie je výsledok. Je to len fáma.

Z mechanizmu vyplývajú aj zásady merania. Pred meraním nechajte všetky vzorky ustáliť na rovnakú teplotu. Používajte rovnaký typ a orientáciu kyvety, zodpovedajúce slepé vzorky s rovnakým obsahom solí a pufra a čisté laboratórne sklo. Metylénová modrá sa totiž adsorbuje na sklo aj plast a zafarbená kyveta si nesie stopu poslednej koncentrovanej vzorky. Keď záleží na kinetike agregácie, merajte bezodkladne po príprave a každú kalibračnú krivku vytvorte v rovnakej matrici a pri rovnakej dĺžke optickej dráhy ako neznáme vzorky. Pri vizuálnych kontrolách pamätajte, že oko je slabý spektrometer. Otázka, či farba roztoku môže preukázať čistotu, je samostatná a odpoveď je záporná. Jedným z dôvodov sú práve zmeny odtieňa spôsobené agregáciou.

Schéma, ktorú sa oplatí mať pri prístroji

Nasledujúci obrázok zhŕňa článok do jednej praktickej pomôcky k laboratórnemu stolu. Tri roztoky obsahujú rovnaké farbivo, no líšia sa celkovou koncentráciou a obsahom solí. Ich schematické spektrá ukazujú, ako s rastúcim vrstvením klesá podiel monomérneho pásu pri dlhšej vlnovej dĺžke v prospech dimérneho pásu pri kratšej vlnovej dĺžke. Podmienky sú uvedené priamo na obrázku, pretože bez nich nemožno krivky opätovne použiť. Namerané polohy pásov za uvedených podmienok nájdete v spektrálnom prehľade. O tom, ako farbivo po rozpustení vstupuje do buniek, sa dočítate v článku o vstupe do buniek prostredníctvom redukcie a rozdeľovania medzi fázy. O tom, ako dávka svetla a geometria ďalej ovplyvňujú fotochemické merania, sa dočítate v článku o expozícii svetlu a geometrii merania.

Základné pravidlo má dve časti. Spektrum identifikuje zmes prítomnú v kyvete za uvedených podmienok. Iba kalibrácia vytvorená za rovnakých podmienok umožňuje previesť absorbanciu na celkovú koncentráciu.