Farbenie metylénovou modrou: mikroskopické metódy a atlas skutočných snímok

Farbenie metylénovou modrou uľahčuje rozlíšenie bunkových štruktúr, ktoré by inak boli pri mikroskopii vo svetlom poli slabo viditeľné. Môže pomôcť študentom nájsť jadro bunky sliznice líca alebo skúmať obrysy a usporiadanie mikroorganizmov. Modrý objekt je však len pozorovanie. Určenie organizmu, jeho meranie a rozhodnutie, či poukazuje na ochorenie, sú samostatné úlohy.

Titulný obrázok ilustruje princíp kontrastu. Atlas nižšie obsahuje skutočné fotografie nezávisle zdokumentovaných vzoriek spolu s pôvodnými informáciami o zdrojoch.

Čo metylénová modrá zvýrazňuje?

Metylénová modrá je zásadité farbivo: jej farebný ión nesie kladný náboj. Ako vysvetľuje OpenStax v časti o farbení vzoriek, zásadité farbivá interagujú so záporne nabitým bunkovým materiálom a môžu zvýrazniť bunky na svetlejšom pozadí. Vo vhodných preparátoch metylénová modrá zvýrazňuje oblasti bohaté na nukleové kyseliny a ďalšie štruktúry, ktoré viažu farbivo.

Pri jednoduchom farbení zabezpečuje kontrast jedno farbivo. Viaceré organizmy preto môžu vyzerať modro bez toho, aby išlo o rovnaký organizmus. Užitočné otázky sú spočiatku opisné: sú objekty okrúhle alebo pretiahnuté, samostatné alebo v zhlukoch, rovnomerne zafarbené alebo s rozlíšiteľnými vnútornými štruktúrami? Skôr než budete farbu interpretovať ako výsledok klasifikácie, pozrite si rozdiel medzi jednoduchým farbením a Gramovým farbením.

Kontrast a rozlíšenie sú odlišné vlastnosti. Kontrast pomáha odlíšiť objekt od jeho okolia; rozlíšenie umožňuje rozlíšiť blízke detaily. Tmavší obraz nezaručuje rozlíšenie väčšieho počtu štruktúr. Ani každá tmavá granula sa nemá označovať za organelu.

Natívne preparáty, farbené mokré preparáty a nátery

Nefarbený, čiže natívny, mokrý preparát umožňuje pozorovanie bez pridaného farbiva, hoci už vyňatie z pôvodného prostredia vzorku mení. Pri farbenom mokrom preparáte sa pridáva činidlo, zatiaľ čo materiál zostáva v kvapaline pod krycím sklíčkom. Pri fixovanom nátere sa materiál rozotrie na podložné sklíčko a pred ďalším spracovaním sa použije určená metóda fixácie. Prehľad prípravy preparátov od OpenStax rozlišuje mokré preparáty a fixáciu a vysvetľuje, prečo fixované organizmy už neumožňujú pozorovať normálny pohyb ani metabolizmus.

Tieto preparáty odpovedajú na rôzne otázky:

Pri porovnávaní počas výučby zaznamenajte nefarbený preparát ešte pred skúmaním samostatného farbeného preparátu pripraveného podľa výučbového protokolu. Udržujte porovnateľné osvetlenie a nastavenia snímania obrazu. Ak fotografujete dve rôzne bunky, opíšte ich ako príklady, nie ako záznam jednej bunky pred farbením a po ňom.

Mikroskopický atlas: tri skutočné farbené vzorky

Tento atlas je pôvodným výberom a interpretáciou troch mikrosnímok s otvorenou licenciou. Autori zdrojových snímok uvádzajú vzorky a použité farbivá. Ich vzorky sme nezávisle neoverovali. Snímky sú reprodukované bez orezania ako bezstratové konverzie do formátu WebP, bez pridaných prvkov či zmien farieb.

Tabuľa 1: bunky ľudskej sliznice líca

Vzorka: bunky ľudskej sliznice líca. Farbivo: metylénová modrá. Zväčšenie: 400×, podľa údajov fotografa. Mierka: nie je dostupná; zdroj neuvádza kalibrovanú veľkosť pixelu. Fotografia od Fritzmann2002, 2017, zo zdroja Bunky ľudskej sliznice líca (farbenie metylénovou modrou), s licenciou CC BY-SA 4.0. Táto reprodukcia si zachováva uvedenú licenciu.

Začnite samostatnou bunkou: jej tmavšie jadro sa ľahšie odlišuje od okolitej modrej cytoplazmy. Potom preskúmajte prekrývajúce sa bunky pod ňou. Prekrývanie sťažuje sledovanie hranice a môže vytvoriť lokálne tmavšiu oblasť. Na tejto tabuli si precvičujte sledovanie obrysov, nie počítanie každej tmavej škvrny ako jadra. Sprievodca pozorovaním buniek sliznice líca rozvíja cvičenie zamerané na tento typ vzorky.

Tabuľa 2: bunky cibule

Vzorka: bunky cibule podľa identifikácie v zdroji. Farbivo: metylénová modrá. Zväčšenie: „200x“ je uvedené v pôvodnom názve súboru; nie je nezávisle overené. Mierka: nie je dostupná; kalibrácia nie je uvedená. Fotografia od Alvy16, 2019, zo zdroja Bunka cibule 200x, s licenciou CC BY 4.0.

Pretiahnuté oddiely tvoria usporiadanú vrstvu. Porovnajte ich dlhé spoločné hranice s nepravidelnými obrysmi na tabuli 1. Všimnite si aj výrazný tmavý materiál a nerovnomerný jas zorného poľa. Fotografia neurčuje identitu každého tmavého depozitu. Ukazuje, prečo užitočný záznam pozorovania zahŕňa artefakty a neistotu namiesto označovania všetkého, čo sa zafarbí.

Tabuľa 3: kvasinky označené v zdroji ako Candida spp.

Vzorka: Candida spp., podľa fotografa. Farbivo: jednoduché pozitívne farbenie metylénovou modrou. Zväčšenie: nie je dostupné. Mierka: nie je dostupná; kalibrovaná veľkosť pixelu nie je uvedená. Fotografia od Marty, používateľky Wikimedia Martunia.g, 2021, zo zdroja Pozitívne farbenie metylénovou modrou 2, s licenciou CC BY 4.0.

Porovnajte husté modré zhluky s menej zaplnenými okrajmi. Jednotlivé obrysy sa ľahšie sledujú tam, kde sa objekty menej prekrývajú. Názov Candida pochádza zo zdrojového záznamu, nie z druhovej identifikácie vykonanej na základe tejto fotografie. Táto tabuľa neposkytuje ani výsledok hodnotenia životaschopnosti. Testy životaschopnosti a respirácie kvasiniek vyžadujú vlastné podmienky, kontroly a interpretáciu.

Správne čítanie mierky

Tieto tabule umožňujú vizuálne porovnávanie, nie meranie v mikrometroch ani porovnávanie absolútnej veľkosti buniek medzi tabuľami. Uvedené zväčšenie nenahrádza chýbajúcu kalibráciu kamery. Zmena zobrazenej veľkosti snímky mení jej zdanlivé zväčšenie.

Pri vlastných snímkach vykonajte kalibráciu merania pomocou známeho etalónu a príslušnej optickej zostavy. Sprievodca mikrometriou od spoločnosti Nikon vysvetľuje, ako objektový mikrometer prevádza ľubovoľné dieliky obrazu alebo okulárovej stupnice na fyzické dĺžky. Zaznamenajte objektív, konfiguráciu kamery a kalibráciu a na základe týchto údajov pridajte grafickú mierku. Neodvodzujte ju z priemernej veľkosti bunky uvedenej v učebnici.

Zodpovedá obsah fľaše metóde?

Fľaša označená ako metylénová modrá nepredstavuje úplnú laboratórnu špecifikáciu. Skontrolujte koncentráciu a jednotky, rozpúšťadlo, ďalšie zložky, zamýšľané použitie, dokumentáciu šarže a pokyny. Karta bezpečnostných údajov činidla opisuje nebezpečenstvá; pokyny k metóde určujú, ako ho použiť pri zamýšľanej príprave preparátu.

Konkrétnym príkladom je Löfflerov roztok metylénovej modrej od spoločnosti Merck. Výrobca ho označuje ako činidlo na mikroskopiu a opisuje jeho úlohu ako kontrastného farbiva pri farbení acidorezistentných organizmov. Uvedená horľavosť zároveň ukazuje, prečo „modrá kvapalina“ nie je dostatočná informácia na plánovanie manipulácie či zahrievania. Tieto vlastnosti sa vzťahujú na dané zloženie, nie automaticky na každý vodný roztok metylénovej modrej.

Podobne je eozín-metylénový modrý agar kultivačné médium s definovaným zložením. Nie je to farbiaci preparát vytvorený pridaním samotnej metylénovej modrej k vzorke na sklíčku. Ak máte iný cieľ zobrazovania, porovnajte alternatívy metylénovej modrej pri mikroskopii.

Pri mikroskopickej súprave pre začiatočníkov začnite jej zdokumentovanou výučbovou metódou, známymi hotovými preparátmi a určeným činidlom. Ak fľaša stratila etiketu alebo sa jej zloženie nedá zistiť, nahraďte ju vhodným činidlom s dokumentáciou. Používajte ochranu očí a dodržiavajte pokyny na manipuláciu dodané pre konkrétne zloženie. Ľudský materiál a neznáme vzorky z prostredia vyžadujú postupy výučbového laboratória na manipuláciu so vzorkami a ich likvidáciu; farbenie tieto postupy nenahrádza.

Najprv zapíšte pozorovanie, až potom záver

„Modré oválne objekty v zhlukoch“ je obhájiteľný opis obrazu. „Konkrétna infekcia“ vyžaduje dôkazy, ktoré obraz neposkytol. V laboratórnom denníku zaznamenávajte oddelene pôvod vzorky, prípravu, farbiacu reakciu a metódu identifikácie. Toto rozlíšenie robí aj jednoduchú snímku z výučby užitočnou a zabraňuje tomu, aby sa pútavá mikrosnímka používala na podporu tvrdenia, ktoré nedokáže podložiť.