Как работает метиленовый синий: перенос электронов и куда они попадают

Закрытая пробкой колба на лабораторном столе — самое краткое и точное введение в то, как работает метиленовый синий. Вода, глюкоза, щепотка гидроксида натрия и столько красителя, чтобы жидкость приобрела насыщенный, unmistakably синий цвет. Через несколько минут синий цвет исчезает, и колба начинает выглядеть как колба с водой. Встряхните её — и цвет мгновенно вернётся. Затем он снова исчезнет, и цикл будет повторяться, пока есть глюкоза, готовая отдавать электроны, и кислород, готовый их принимать.

В красителе не изменилось ничего, кроме количества электронов, которые он несёт. В окисленной форме он синий. В восстановленной — нет. Почти всё остальное в терапевтической и исследовательской литературе об этой молекуле следует из этого единственного обратимого этапа, потому что молекула, способная принимать электроны от одного партнёра и передавать их другому, представляет собой посредник, а посредник сам по себе ничего не делает. Его действие полностью зависит от того, что находится на каждом конце этой цепи переноса.

Две формы и почему эта пара важна

Окисленная форма представляет собой плоскую положительно заряженную кольцевую систему. Именно эта плоская заряженная структура объясняет, почему она образует стэкинг-взаимодействия с нуклеиновыми кислотами, связывается с сиалилированными структурами клеточных мембран и интенсивно поглощает видимый свет примерно между 600 and 700 nanometres — в той части спектра, которую человеческий глаз воспринимает как синий цвет.

Восстановленная форма ведёт себя иначе. Она не несёт заряда, растворяется в жирах, а не в воде, и бесцветна. При pH внутри организма степень её ионизации очень мала — порядка нескольких процентов. Поэтому восстановленная молекула легко пересекает клеточную мембрану посредством диффузии, а оказавшись внутри, где среда более окислительная, может снова окислиться и фактически оказаться захваченной. Окисленная кольцевая система плоская; восстановленная может изгибаться. Эти структурные последствия, как и само изменение цвета, являются самостоятельной частью истории двух форм и подробнее рассматриваются в сравнении метиленового синего и лейкометиленового синего.

Приём электронов

Окисленный краситель способен принимать электроны от самых разных доноров. Глюкоза в демонстрационной колбе — один из них. Внутри клетки другими донорами являются восстановленные пиридиновые нуклеотиды и компоненты митохондриальной цепи переноса электронов. Когда метиленовый синий восстанавливается в ткани, содержащей кислород, запускаемый им цикл расходует и восстановитель, и кислород, а также образует активные формы кислорода, главным образом перекись водорода. Краситель выходит из этого цикла неизменённым и готов снова его повторить.

Последний момент объясняет противоречие, которое иначе выглядит как небрежность. В литературе метиленовый синий описывают одновременно как прооксидант и антиоксидант, и оба описания имеют основания. Он способен подавлять образование супероксида, выступая искусственным акцептором электронов и отводя их поток от участков ферментов, где в противном случае кислород превращался бы в супероксидные радикалы. В культурах клеток печени было показано, что он индуцирует антиоксидантные защитные ферменты фазы 2, включая тиоредоксинредуктазу 1 и NADPH-хиноноксидоредуктазу. Какая из этих двух сторон проявится, зависит от того, на каком конце цепи переноса в данный момент не хватает электронов. Вопрос «является ли метиленовый синий антиоксидантом» сформулирован некорректно, пока не указано, в какой системе, при какой концентрации и в присутствии каких других веществ.

Передача электронов дальше

После того как краситель получает лишний электрон, далее возможны три совершенно разных сценария, которые обычно объединяют под одним заголовком. Этого делать не следует.

Он может передать электрон металлическому центру. Самый наглядный пример — гемоглобин, в котором железо окислилось из двухвалентного состояния в трёхвалентное. В таком состоянии он не способен переносить кислород. В эритроцитах фермент восстанавливает краситель, после чего восстановленный краситель неферментативно передаёт электроны окисленному железу гема, восстанавливая функциональный гемоглобин и возвращаясь в окисленную форму. Краситель при этом не расходуется; он циркулирует в цикле. Клиническое применение, основанное на этой реакции, относится к стационарной медицине, а объяснение применения метиленового синего при метгемоглобинемии рассматривает, как его используют и почему это требует столь тщательного медицинского наблюдения.

Важное замечание по источникам: два обзора, на которых основана эта статья, называют разные восстанавливающие кофакторы для ферментативного этапа — в одном указан NADH, в другом NADPH. Это реальное расхождение, которое не разрешено доступными здесь источниками, поэтому корректнее описывать роль каждого компонента, а не указывать единственный кофактор.

При наличии света он может передать кислороду энергию или электрон. Этот путь существует только при освещении. Возбуждённая молекула красителя переходит в триплетное состояние, после чего возможны два механизма. При первом возбуждённый краситель напрямую взаимодействует с соседней молекулой, отнимая атом водорода или передавая электрон, в результате чего образуются радикалы; такое взаимодействие с водой приводит к образованию гидроксильных радикалов. При втором энергия возбуждения передаётся непосредственно кислороду, образуя синглетный кислород — высокоэлектрофильную частицу, которая распадается в течение микросекунд и считается основным механизмом, посредством которого освещённый метиленовый синий повреждает микробные клетки. Среди задокументированных результатов — реакции с липидами и пептидами клеточной оболочки, а также с гуаниновыми основаниями DNA.

Практическое следствие этого механизма состоит в том, что освещение изменяет показатели на порядки величины. В данных, собранных Wainwright и Crossley, минимальная бактерицидная концентрация метиленового синего против Pseudomonas aeruginosa составляет около 500 micromolar в темноте и около 25 micromolar при световой дозе 12 joules per square centimetre. Для одного штамма Staphylococcus aureus значения в темноте и при освещении составляют 5 micromolar в обоих случаях. Иными словами, можно ли вообще считать молекулу антимикробной, зависит не только от самой молекулы; это свойство системы «молекула плюс свет».

Он может действовать непосредственно на участке фермента, без участия цепи переноса. Метиленовый синий окисляет двухвалентное железо, связанное с синтазой оксида азота, что инактивирует фермент. Он блокирует растворимую гуанилатциклазу, и 1 to 10 micromolar — стандартная лабораторная концентрация, используемая для этой цели. Он ингибирует моноаминоксидазу типа A с IC50 между 27 and 180 nanomolar; именно этот механизм лежит в основе хорошо задокументированного взаимодействия с ингибиторами обратного захвата серотонина и объясняет, почему лекарственные взаимодействия метиленового синего рассматриваются как отдельная категория.

Эти три пути химически различны. Сведение их к единственному утверждению, что метиленовый синий действует за счёт окислительно-восстановительного циклирования, — главная причина того, почему многие тексты о нём одновременно звучат уверенно и остаются расплывчатыми.

Четыре различия, от которых зависит смысл утверждения о механизме

Какая форма. Восстановленный краситель не взаимозаменяем с окисленным. Ингибирование ацетилхолинэстеразы хорошо показывает эту ловушку: при длительной инкубации in vitro метиленовый синий постепенно восстанавливается до своей бесцветной формы, и ингибирование ослабевает, поскольку восстановленная молекула не ингибирует этот фермент. Анализ, который длится достаточно долго, чтобы форма вещества изменилась, покажет более слабый эффект и подтолкнёт к неверному объяснению.

Какая концентрация. Лабораторный диапазон для ингибирования растворимой гуанилатциклазы составляет 1 to 10 micromolar. Для полного подавления глутамат-опосредованной передачи в срезах гиппокампа крысы потребовалось 5 to 50 micromolar. Токсические эффекты в культуре клеток описаны при концентрациях выше 100 micromolar. Это разные эксперименты, и механизм, подтверждённый при 50 micromolar, не обязательно будет действовать у пациента, чья концентрация в плазме составляет лишь долю этого значения.

Какой путь введения. Абсолютная биодоступность при пероральном приёме составляет около 72 per cent, а конечный период полувыведения из плазмы — 5 to 7 hours. Пероральное введение создаёт более высокие концентрации в кишечнике и печени; внутривенное — более высокие концентрации в мозге. Путь введения определяет, какая ткань окажется в зоне переноса электронов.

Какая модель и был ли включён свет. Значительная часть литературы по механизмам основана на культурах клеток и исследованиях на грызунах, а результаты in vitro для этой молекулы зависят от освещения, мембранного потенциала и окислительно-восстановительного состояния клеток, поскольку даже света микроскопа достаточно для её фотосенсибилизации. Между 65 and 85 per cent введённой дозы восстанавливается до бесцветной формы в эритроцитах и периферических тканях. Каждая из этих переменных находится между чистым механизмом, наблюдаемым в лабораторной чашке, и утверждением о человеке.

Почему вопрос чистоты — это вопрос химии

Под действием света метиленовый синий деметилируется. Первым продуктом становится Azure B, затем Azure A, затем тионин, причём более высокая интенсивность света приводит к большему распаду, чем более низкая. Следовательно, молекула, полезные свойства которой основаны на способности принимать и отдавать электроны, имеет вероятные продукты разложения, являющиеся близкими химическими родственниками и остающиеся в том же растворе. Состав содержимого ёмкости — не косметическая деталь.

Поэтому соответствие спецификации USP является значимым критерием для покупателя. Продукт, который ей не соответствует, остаётся красителем, а краситель может содержать примеси, включая Azure B, тяжёлые металлы и остаточные растворители, которые человеку, принимающему его внутрь, не нужны. Дополнительная ловушка — продавец, который проверяет только тяжёлые металлы и представляет такой результат как полное соответствие требованиям. Blupreme сотрудничает с фармацевтическим производителем метиленового синего и проверяет полную спецификацию: идентичность, чистоту, органические примеси, остаточные растворители, элементные примеси, остаток после прокаливания, микробиологические пределы и бактериальные эндотоксины. Документ о лабораторном тестировании каждой партии публикуется, а выбор поставщика в значительной степени сводится к проверке того, существует ли такой документ и что именно он охватывает.

Одна обратимая пара. Несколько возможных путей. Именно путь определяет, какое утверждение допустимо.