История метиленового синего: от красителя к лекарству и исследованиям

Метиленовый синий попал к пациенту раньше, чем в аптеку.

В отчёте Пауля Гуттмана и Пауля Эрлиха 1891 года об использовании красителя при малярии приведены два температурных графика. Второй охватывает период с 13 июля по 5 августа, а назначенное лечение день за днём записано на полях. В записях за 18 и 19 июля указано «1 × 0,05 Methylenblau». В последующие дни отмечены пять и семь доз того же количества, а к 22 июля в записи появляется небольшое количество хинина. Температурная кривая, колеблющаяся между 37 °C и 39.5 °C в первой половине графика, после появления красителя выравнивается и в оставшиеся три недели остаётся примерно между 36 °C и 37.5 °C.

Пациент был одним из двух; в статье они описаны как домашний слуга и моряк. Полученное ими соединение к тому моменту уже пятнадцать лет продавалось как текстильный краситель, и эти двое относятся к числу первых документированно зафиксированных людей, которых лечили полностью синтетическим лекарственным средством, направленным против конкретного организма.

Сначала появился краситель

Первый коммерчески успешный синтетический краситель создал Уильям Генри Перкин в 1856 году. Перкину было восемнадцать лет; во время пасхальных каникул он работал в домашней лаборатории и пытался синтезировать хинин. Вместо этого он получил чёрный осадок, растворил его и обнаружил краситель, который ярко и стойко окрашивал шёлк. В августе 1856 года он запатентовал его, а к концу 1857 года уже имел фабрику, снабжавшую лондонское предприятие по окрашиванию шёлка.

В 1875 году Адольф фон Байер синтезировал красный краситель и назвал его эозином — от Эос, греческого слова, обозначающего зарю. В 1876 году Генрих Каро, тогда возглавлявший лабораторию Badische Anilin- und Soda-Fabrik, совместно с Байером разработал метиленовый синий как краситель на основе анилина для хлопка. Его химическая структура была окончательно установлена лишь примерно девять лет спустя.

Это происхождение до сих пор отражено в названии вещества. «Метиленовый синий» — торговое название из каталога красителей, а не химическое описание. Соединение, которое оно обозначает, представляет собой хлорид метилтиониния, и различия между названием, солью и её гидратами становятся существенными, как только кто-либо начинает взвешивать материал или читать спецификацию.

Окрашивание стало связующим звеном

Путь от красильного производства к больнице проходил через микроскоп и начался ещё до появления метиленового синего. Вильгельм Эрб первым применил синтетический краситель для окрашивания крови, использовав в 1865 году пикриновую кислоту, и увидел сетчатый рисунок внутри некоторых эритроцитов.

В докторской диссертации Пауля Эрлиха 1878 года гистологическое окрашивание сравнивалось с окрашиванием тканей и утверждалось, что оба процесса являются химическими реакциями. Работая под руководством Роберта Коха с туберкулёзной палочкой, он разделил анилиновые красители на кислотные и основные классы и установил, что каждый класс окрашивает разные части клетки. В 1880 году он смешал их: насыщенный раствор метиленового синего добавляли к кислому фуксину до тех пор, пока надосадочная жидкость не становилась прозрачной. Получившийся состав, который он назвал neutralen Farbkörper, или нейтральным красителем, давал три цвета вместо одного, выявлял ранее невидимые гранулы в полиморфноядерных клетках и сделал возможным первый дифференциальный подсчёт лейкоцитов. Поскольку эти гранулы воспринимали оба компонента смеси, Эрлих ввёл слово нейтрофил для клеток, содержащих их.

Два года спустя Кох использовал метиленовый синий для обнаружения туберкулёзной палочки, а в 1883 году Эрлих усовершенствовал метод. В 1886 году он опубликовал наблюдение другого рода: вводил краситель живым животным, сравнивал, насколько интенсивно его накапливали различные органы, и пришёл к выводу, что вещество обладает выраженным сродством к ткани мозга и нервной ткани. Он связывал это сродство с окислительно-восстановительным циклированием красителя, которое наблюдал годом ранее. По этой же причине раствор метиленового синего теряет цвет при расходовании кислорода и вновь приобретает его после контакта с воздухом. Эксперименты, впервые измерившие последствия этого циклирования, относятся уже к следующему десятилетию, а сам механизм — отдельная от истории тема.

Паразит и фиолетовое ядро

Альфонс Лаверан обнаружил малярийного паразита в 1880 году, исследуя свежую неокрашенную кровь. Чтобы регулярно видеть его в высушенном мазке, требовалось окрашивание, а доступные тогда методы давали только красный и синий цвета.

В 1888 году польский патолог Чеслав Хенциньский заменил кислый фуксин эозином, получив смесь метиленового синего и эозина. В основе его метода лежал случай солдата, умершего от малярии 30 сентября 1887 года. В мазках крови Хенциньский увидел синие формы, напоминающие маргаритки, которые сегодня распознаются как Plasmodium malariae, а также серповидные формы, ныне известные как гаметоциты Plasmodium falciparum. Этот результат одновременно положил конец двум конкурировавшим объяснениям болезни: миазматической теории и утверждению Эдвина Клебса и Коррадо Томмази-Крудели о том, что малярию вызывает бактерия.

Паразит был виден. Его ядро — нет, поэтому природа организма оставалась неясной. Эрнст Малаховский, врач из Бреслау, решил эту проблему сначала случайно, а затем целенаправленно. В 1889 году он заметил дифференциальное окрашивание ядра плазмодия в одном препарате, но не смог воспроизвести результат. Подкисление метиленового синего не помогло. Подщелачивание бурой воспроизводило эффект каждый раз. Он публично продемонстрировал метод 15 июня 1890 года и опубликовал его в том же году, а более подробное описание методики вышло в августе 1891 года.

Дмитрий Романовский опубликовал собственный вариант в сентябре 1891 года. Наилучшие результаты он получил из заброшенной, заплесневевшей бутылки раствора метиленового синего возрастом более двух месяцев. Метод Малаховского был намеренно разработан и, по его словам, легко воспроизводим; метод Романовского оказался тупиковым вариантом, который сработал один раз. Тем не менее эпоним достался Романовскому, а спор о том, кто получил фиолетовую окраску, сделавшую ядро видимым, — отдельная история со своими документами.

Рисунок: второй температурный график из отчёта Гуттмана и Эрлиха 1891 года. Верхняя панель охватывает период с 13 по 24 июля, нижняя — с 25 июля по 5 августа; записи на полях указывают назначенные дозы, а в последние три недели наблюдения температура остаётся близкой к нормальной. Воспроизведено по отчёту в скане, опубликованном у Krafts, Hempelmann и Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Оказалось, что «созревание» было деметилированием

Никто из работавших в 1890-х годах не знал, что именно «созревание» делает с метиленовым синим. Ответ пришёл из промышленной химии. Генрих Август Бернтзен в 1883 году синтезировал исходное соединение фенотиазин, в 1885 году установил, что метиленовый синий относится к этому семейству, и примерно в тот же период показал, что в щелочных условиях от красителя отщепляются метильные группы, образуя соединения, которые сегодня называют азурами.

Бернард Нохт выделил активную фракцию в 1898 и 1899 годах и мог назвать её лишь Rot aus Methylenblau — красным из метиленового синего. В 1901 году Михаэлис идентифицировал её как азур I. В 1899 году Дженнер ввёл абсолютный метанол в качестве растворителя для осадка красителя, что устранило необходимость термической фиксации мазков крови; Лейшман и Ройтер объединили оба усовершенствования; Райт опубликовал упрощённый метод в 1902 году. Вклад Гимзы, также в 1902 году, заключался в отказе от случайно «созревшего» раствора в пользу измеренных количеств известных красителей. Затем он отказался публиковать способ получения чистого метиленового азура и продал метод лаборатории доктора Грюблера, которая вывела продукт на рынок как азур I и утверждала, что только её вариант является подлинной окраской по Гимзе.

Две мировые войны случайно довели эту работу до завершения. Когда немецкие красители стали недоступны, Лилли, Роу и Уилкокс исследовали американские заменители и обнаружили, что наилучшее окрашивание обеспечивают три раздельных компонента: чистый метиленовый синий, продукт его распада Azure B и эозин. Эти три вещества и сегодня остаются основными компонентами окраски, используемой для диагностики малярии, под названием, которое теперь объединяет имена Малаховского, Райта и Гимзы.

Рисунок: кольцевидные формы Plasmodium falciparum в эритроцитах человека, окрашенные методом типа Романовского. Фиолетовая структура внутри кольца — хроматин, который впервые стал видимым благодаря обработанному бурой метиленовому синему Малаховского. Изображение Эрнста Хемпельмана, передано в общественное достояние.

Одно название, несколько материалов

Годы, потребовавшиеся для разделения этих компонентов, оставили проблему, пережившую саму химическую задачу. В 1969 году Ральф Лилли провёл границу между биологическими красителями, «изготавливаемыми по строгим спецификациям, соответствующим их деликатному и требовательному применению», и небиологическими красителями для текстиля, которые «требуют менее строгих и менее жёстких стандартов производства». Продукты обоих типов носили одно и то же название, но различие между ними никогда не сводилось лишь к степени качества. Спецификация, составленная для хлопка, и спецификация диагностического реагента не взаимозаменяемы, а материал, изготовленный по текстильной спецификации, не предназначался для проглатывания.

Azure B — наиболее наглядный пример. Это монометилированная форма метиленового синего после удаления одной метильной группы; она обладает собственной измеримой фармакологической активностью и более века присутствовала как неконтролируемый компонент клинических препаратов метиленового синего, прежде чем эти два вещества разделили. Одна исследовательская группа обнаружила, что в тканях человека, взятых при аутопсии после введения метиленового синего, содержалось от 5 до 14 процентов неизменённого метиленового синего и от 86 до 95 процентов Azure B. Должен ли конкретный препарат содержать Azure B и в каком пределе — вопрос спецификации, и далее его рассматривают исследования Azure B как примеси и метаболита.

Практическое значение также определяется спецификацией. Соответствие USP — путь к наивысшей чистоте, предлагаемой рынком, поскольку USP представляет собой полный опубликованный стандарт испытаний, а не одно отдельное измерение. Он охватывает идентификацию, количественное содержание, органические примеси, включая азуровые красители, остаточные растворители, элементные примеси, остаток после прокаливания, микробиологические пределы и бактериальные эндотоксины. Сертификат, в котором приведён результат анализа на тяжёлые металлы и это названо соответствием USP, отражает лишь одну строку из этого перечня.

Blupreme получает метиленовый синий у фармацевтического производителя и публикует полный сертификат анализа, проверяя соответствие всей спецификации USP, а не только содержание тяжёлых металлов. Руководство по чтению сертификата анализа и материал о том, что обозначение USP устанавливает, а чего не подтверждает, объясняют, как сопоставить документ с заявленным соответствием.

Что позволяет утверждать история, а что — нет

Историческая преемственность реальна и длиннее, чем можно заключить по большинству страниц продуктов. Метиленовый синий применяли при малярии в 1891 году, в 1899 году сообщалось о его использовании как седативного средства при возбуждённом психозе, а его химическая боковая ветвь проходит через хинакрин, хлорохин, прометазин и хлорпромазин. В статье Эрлиха и Артура Леппмана 1890 года описывалось облегчение невралгической и ревматической боли, после чего авторы рассмотрели возможность применения красителя при психических заболеваниях, но отказались от его испытания в этой области.

Ничто из этого не подтверждает современное применение. Результат 1891 года при малярии — это два пациента и температурный график. Длительное знакомство с молекулой — основание изучать её, а не готовый результат. История соединения как лекарственного средства и современные исследования при малярии отвечают на другие вопросы, чем те, которые ставил Эрлих, и конечные точки этих исследований необходимо оценивать в соответствии с их собственными условиями.

В исторических данных есть одна деталь, относящаяся скорее к настоящему, чем к прошлому. Когда в 2000-х годах исследователи проводили испытания метиленового синего при малярии в Буркина-Фасо, им пришлось конкурировать за материал фармацевтического качества; они сообщали, что цена сырья выросла примерно в сто раз после получения подтверждения соответствия GMP. Краситель можно было заменить. Лекарственное средство — нельзя. Различие, которое Лилли провёл в 1969 году, и сегодня определяет, что именно находится во флаконе.