Cum pătrunde albastrul de metilen în celule: reducere, reoxidare, captare

Dacă urmăriți cum celulele endoteliale dintr-o placă de cultură captează albastrul de metilen, interpretarea evidentă este și cea greșită. Mediul își pierde culoarea albastră, iar în celule apar granule albastre, așadar colorantul trebuie să fi traversat membrana sub forma moleculei albastre. Experimentele arată altceva. Forma albastră abia traversează membrana. Ceea ce o traversează este forma incoloră, iar albastrul pe care îl vedeți în interior se formează acolo, după pătrundere.

Această inversare contează, deoarece stabilește ce poate și ce nu poate indica o colorare. Granulele albastre indică prezența colorantului oxidat, care a fost reoxidat și reținut în organite. Ele nu indică întreaga cantitate de colorant din celulă, nu indică fracțiunea redusă și nu măsoară efectul biologic. Pentru a înțelege de ce, urmăriți cele trei etape: reducerea la suprafață, difuzia formei reduse, reoxidarea și reținerea în interior.

Cele două forme se comportă ca molecule diferite

Albastrul de metilen oxidat are un sistem de inele plan, cu sarcină pozitivă. Se dizolvă în apă, absoarbe puternic lumina în intervalul de aproximativ 600 până la 700 nanometri și are aspect albastru. Sarcina electrică este elementul esențial. O moleculă încărcată electric, hidrofilă, nu traversează ușor o membrană lipidică, astfel că formularea prudentă din literatura de specialitate este relativ impermeantă prin membrană, nu impermeantă.

Albastrul de metilen redus, numit leucoalbastru de metilen, este incolor, lipsit de sarcină electrică și liposolubil. Odată îndepărtată sarcina, membrana nu mai constituie o barieră. Molecula redusă difuzează cu ușurință prin ea și, odată ajunsă într-un compartiment cu un mediu mai oxidant, poate pierde din nou electroni și poate reveni la forma albastră, încărcată electric și reținută în interior. Prin urmare, chimia redox a colorantului este și mecanismul său de transport. Modificarea numărului de electroni modifică permeabilitatea.

Electronii necesari primei etape provin chiar din celulă. Celulele mamiferelor realizează transportul electronilor prin membrana plasmatică, transferând echivalenți reducători de la donatori intracelulari către acceptori aflați la suprafață. Această activitate transmembranară este o funcție celulară normală, întâlnită în majoritatea tipurilor de celule, iar reductaza de la suprafața endoteliului care acționează asupra coloranților tiazinici se comportă asemenea altor reductaze într-o privință revelatoare: continuă să funcționeze în prezența cianurii și a azidei la doze care blochează etapele ulterioare. Această separare este punctul-cheie al întregii explicații.

Partiționarea a fost prima explicație și aproape a explicat captarea

În 1929, Marian Irwin, de la Institutul Rockefeller, a pus o întrebare mai simplă. Poate că pătrunderea colorantului este doar o partiționare între apă și straturile lipidice ale celulei, iar un strat de cloroform poate înlocui aceste straturi lipidice în laborator. În studiile sale spectrofotometrice privind pătrunderea coloranților, a agitat soluții apoase de colorant împreună cu cloroform și a comparat ceea ce trecea în faza organică cu ceea ce pătrundea în celule vii de alge.

Două constatări din acele cercetări merită în continuare atenție. În primul rând, soluțiile comerciale de albastru de metilen conțineau trimetiltionină, numită astăzi Azure B, iar impuritatea pătrundea mai rapid decât albastrul de metilen propriu-zis, mai ales la pH alcalin, unde predomină forma de bază liberă liposolubilă. O parte din pătrunderea aparentă a albastrului de metilen era, în realitate, pătrunderea selectivă a Azure B. În al doilea rând, pH-ul determina rezultatul prin stabilirea stării de ionizare, iar celulele lezate permiteau pătrunderea unei cantități mult mai mari de colorant decât cele intacte. Coeficienții de partiție și starea de încărcare electrică determinau ceea ce absorbeau atât sistemul artificial, cât și celula vie, iar asemănarea dintre cele două susținea ideea existenței unor straturi neapoase la limita celulei.

Modelul a anticipat corect rolul lipidelor și al ionizării, dar nu putea distinge între un colorant care se partiționează în forma sa inițială și unul care este transformat chimic la suprafață, traversează într-o altă formă și este transformat înapoi în interior. Această distincție necesita un alt experiment, care a venit șaptezeci de ani mai târziu, în endoteliul pulmonar.

Reducere în exterior, reținere în interior

Merker și colegii săi au lucrat cu celule endoteliale din artera pulmonară bovină, cultivate în laborator, și au propus o succesiune în trei etape: colorantul oxidat este redus la suprafața celulară la forma sa incoloră, lipofilă, forma redusă difuzează în interior, iar reoxidarea intracelulară regenerează forma oxidată, impermeantă prin membrană, care se acumulează. Studiul lor privind captarea coloranților tiazinici de către endoteliu a testat apoi această succesiune, încercând să o întrerupă în puncte precise.

Primul instrument a fost fericianura, un acceptor de electroni care nu poate pătrunde în celulă. Când enzimele de la suprafață reduc colorantul albastru la forma sa incoloră în exteriorul celulei, fericianura poate prelua acei electroni, regenerând colorantul albastru în mediu înainte ca acesta să traverseze membrana. Cât timp fericianura a fost prezentă în exces (10 micromolari de colorant față de 50 până la 500 micromolari de fericianură), captarea colorantului aproape s-a oprit, iar captarea a revenit la viteza normală numai după consumarea fericianurii. Cinetica a indicat același lucru într-un alt mod. Fericianura dispărea cu o viteză aproximativ constantă, în concordanță cu un flux constant de reducere la suprafață care alimenta un mediator reciclabil, în timp ce colorantul extracelular dispărea exponențial pe măsură ce cantitatea sa disponibilă se epuiza. Un flux constant, împreună cu epuizarea unei cantități disponibile, înseamnă că semnalul fericianurii indică o reducere continuă, nu ieșirea moleculelor de colorant din soluție.

Al doilea instrument a eliminat complet etapa traversării membranei. Grupul a legat albastrul de toluidină O, un colorant tiazinic înrudit îndeaproape, de un lanț mare de poliacrilamidă, prea mare pentru a pătrunde în celulă în oricare dintre stările de oxidare. Celulele au redus totuși colorantul legat de polimer. Prin urmare, reducerea nu necesită acces intracelular. Sistemul care o realizează este expus la suprafață sau cuplat electric cu aceasta.

A urmat apoi separarea care dă titlul articolului științific. Cianura și azida, la 2 milimolari, au diminuat puternic acumularea colorantului, iar la microscop incluziunile albastru-închis și violet care înconjoară în mod normal nucleul aproape au dispărut. Totuși, niciunul dintre inhibitori nu a încetinit reducerea extracelulară: ciclul fericianurii a continuat fără diminuare, iar polimerul care nu putea traversa membrana era în continuare redus. Blocajul era într-o etapă ulterioară. Cianura și azida opreau reoxidarea și sechestrarea intracelulară, nu reducerea la suprafață. Controalele de viabilitate au susținut această interpretare, deoarece celulele și-au păstrat enzima marker citosolică, lactat-dehidrogenaza, pe parcursul acestor tratamente; prin urmare, pierderea captării nu era doar rezultatul toxicității sau al ruperii membranei.

O precizare prudentă din articol rămâne valabilă. Incluziunile albastre se aflau în jurul nucleului, dar nu în interiorul lui, ceea ce este compatibil cu oxidarea în organite subcelulare, însă studiul nu a identificat care organite. Tipare similare din alte tipuri de celule fuseseră considerate lizozomale pe baza unor dovezi slabe. Considerați reținerea ca fiind demonstrată, iar localizarea ca fiind provizorie. Cititorii care urmăresc traseul ulterior al electronilor pot continua cu transportul mitocondrial al electronilor și procesele redox și cu perspectiva mai amplă asupra absorbției și distribuției în funcție de calea de administrare.

Colorarea nu reprezintă expunerea

Un al treilea studiu arată ce se întâmplă atunci când această logică a captării este pusă în relație cu un indicator biologic. Scott și colegii săi au constatat că metil-beta-ciclodextrina, un zaharid cu formă toroidală, se leagă direct de albastrul de metilen, cu o constantă de asociere de aproximativ 310 pe molar pentru complexul de incluziune, față de aproximativ 5846 pe molar pentru dimerizarea colorantului. În fibroblastele L929, această legare a blocat atât colorarea celulară, cât și stimularea captării glucozei: preincubarea cu ciclodextrina a împiedicat colorarea albastră, iar adăugarea ei ulterior a accelerat decolorarea. Pe măsură ce semnalul optic albastru dispărea din celule, intensificarea transportului glucozei se diminua în strânsă concordanță.

Autorii au interpretat această corelație ca favorizând o interacțiune directă între colorant și o proteină din calea de activare a transportorului de glucoză, mai degrabă decât un mecanism de stres oxidativ de lungă durată. Această concluzie este rezonabilă, dar are limite. Experimentul nu identifică proteina, nu demonstrează legarea de transportorul propriu-zis, iar corelația dintre decolorare și pierderea efectului nu poate exclude toate căile mediate de procese redox.

Lecția care rămâne valabilă privește măsurarea. Colorarea optică indică prezența colorantului vizibil, oxidat și asociat celulei. Ea nu detectează deloc fracțiunea redusă, incoloră, astfel că o celulă slab colorată poate conține în continuare echivalenți de colorant, iar o celulă intens colorată indică prezența colorantului oxidat reținut, nu expunerea tisulară totală sau amploarea efectului. Aceeași precauție se aplică și la scară mai mare: compararea colorării între tipuri de celule sau considerarea unei secțiuni tisulare intens colorate drept dovadă a unei expuneri mai mari repetă eroarea inițială din placa de cultură. Captarea este un ciclu de reducere, difuzie și reoxidare, iar orice imagine de moment a formei albastre surprinde doar o parte a acestuia. Consecințele practice pentru colorarea și manipularea în laborator și pentru interpretarea afirmațiilor privind doza și expunerea decurg direct de aici.