Articol
Colorarea cu albastru de metilen: metode de microscopie și un atlas cu imagini reale
Colorarea cu albastru de metilen face mai ușor de distins detaliile celulare altfel slab vizibile în microscopia în câmp luminos. Îi poate ajuta pe elevi și studenți să localizeze nucleul unei celule din mucoasa bucală sau să examineze conturul și dispunerea microorganismelor. Un obiect albastru reprezintă însă o observație. Identificarea organismului, măsurarea lui și stabilirea faptului că indică sau nu o boală sunt sarcini separate.
Imaginea de copertă ilustrează principiul contrastului. Atlasul de mai jos conține fotografii reale ale unor probe documentate independent, împreună cu informațiile originale despre sursele lor.
Ce evidențiază albastrul de metilen?
Albastrul de metilen este un colorant bazic: ionul său colorat are sarcină pozitivă. După cum explică OpenStax în prezentarea colorării probelor, coloranții bazici interacționează cu materialul celular încărcat negativ și pot face celulele să iasă în evidență pe un fundal mai deschis. În preparate adecvate, albastrul de metilen evidențiază regiunile bogate în acizi nucleici și alte structuri care leagă colorantul.
Într-o colorare simplă, contrastul este asigurat de un singur colorant. Prin urmare, organisme diferite pot apărea albastre fără să fie același organism. Întrebările utile sunt, inițial, descriptive: obiectele sunt rotunde sau alungite, izolate sau grupate, colorate uniform sau diferențiate în interior? Consultați diferența dintre colorarea simplă și colorarea Gram înainte de a interpreta culoarea drept rezultat al unei clasificări.
Contrastul și rezoluția sunt lucruri diferite. Contrastul ajută la distingerea unui obiect de ceea ce îl înconjoară; rezoluția permite separarea detaliilor apropiate. O imagine mai întunecată nu garantează că pot fi distinse mai multe structuri. Nici fiecare granulă întunecată nu trebuie etichetată drept organit.
Preparate native, preparate umede colorate și frotiuri
Un preparat umed necolorat, sau nativ, permite observarea fără adăugarea unui colorant, deși scoaterea probei din mediul său inițial o modifică totuși. Într-un preparat umed colorat se adaugă reactiv cât timp materialul rămâne în lichid, sub o lamelă. Un frotiu fixat presupune întinderea materialului pe o lamă și utilizarea unei metode de fixare specificate înainte de prelucrarea ulterioară. Prezentarea metodelor de preparare de la OpenStax face distincția între preparatele umede și fixare și explică de ce organismele fixate nu mai permit observarea mișcării sau a metabolismului normal.
Aceste preparate răspund unor întrebări diferite:
| Preparat | Observație utilă | Ce nu poate stabili imaginea de una singură |
|---|---|---|
| Preparat umed nativ | Mișcare, contururi, material vizibil în mod natural | Identitatea doar pe baza mișcării sau a formei |
| Preparat umed colorat | Contrast între structurile care leagă colorantul și ceea ce le înconjoară | Dacă reactivul a lăsat fiziologia normală neschimbată |
| Frotiu fixat și colorat | Morfologia păstrată după o preparare bine definită | Cum se comporta proba vie inițială |
| Metodă diferențială denumită | O reacție de colorare specificată, cu controale adecvate | Identitatea speciei sau diagnosticul fără ansamblul de dovezi necesar metodei |
Pentru o comparație la clasă, documentați un preparat necolorat înainte de a examina un preparat colorat separat, realizat conform protocolului didactic. Mențineți condiții comparabile de iluminare și de captare a imaginilor. Dacă fotografiați două celule diferite, descrieți-le ca exemple, nu ca o documentare a aceleiași celule înainte și după colorare.
Atlas de microscopie: trei probe reale colorate
Acest atlas reprezintă o selecție și o interpretare originale ale unor microfotografii publicate sub licențe deschise. Autorii surselor identifică probele și coloranții. Nu am autentificat independent probele lor. Imaginile sunt reproduse fără decupare, prin conversie în WebP fără pierderi, fără detalii adăugate sau modificări de culoare.
Planșa 1: celule din mucoasa bucală umană
Probă: celule din mucoasa bucală umană. Colorant: albastru de metilen. Mărire: 400×, raportată de fotograf. Bară de scară: indisponibilă; sursa nu oferă o dimensiune calibrată a pixelului. Fotografie de Fritzmann2002, 2017, din Celule din mucoasa bucală umană (colorare cu albastru de metilen), sub licența CC BY-SA 4.0. Această reproducere păstrează aceeași licență.
.jpg){kind=link}
Începeți cu o celulă izolată: nucleul său mai întunecat este mai ușor de distins de citoplasma albastră din jur. Apoi examinați celulele suprapuse de sub ea. Suprapunerea face conturul mai greu de urmărit și poate crea o regiune locală mai întunecată. Folosiți această planșă pentru a exersa urmărirea contururilor, nu pentru a număra fiecare pată întunecată drept nucleu. Ghidul de observare a celulelor din mucoasa bucală dezvoltă exercițiul specific acestei probe.
Planșa 2: celule de ceapă
Probă: celule de ceapă, conform identificării din sursă. Colorant: albastru de metilen. Mărire: „200x” apare în numele fișierului original; nu este validată independent. Bară de scară: indisponibilă; nu este furnizată nicio calibrare. Fotografie de Alvy16, 2019, din Celulă de ceapă 200x, sub licența CC BY 4.0.
Compartimentele alungite formează un strat organizat. Comparați limitele lor comune lungi cu contururile neregulate din Planșa 1. Observați și materialul întunecat evident, precum și luminozitatea neuniformă a câmpului. Fotografia nu stabilește identitatea fiecărui depozit întunecat. Ea arată de ce o consemnare utilă a observațiilor include artefactele și incertitudinea, în loc să eticheteze tot ceea ce se colorează.
Planșa 3: levuri identificate de sursă drept Candida spp.
Probă: Candida spp., potrivit fotografului. Colorare: colorare pozitivă simplă cu albastru de metilen. Mărire: indisponibilă. Bară de scară: indisponibilă; nu este furnizată o dimensiune calibrată a pixelului. Fotografie de Marta, utilizatoarea Wikimedia Martunia.g, 2021, din Colorare pozitivă cu albastru de metilen 2, sub licența CC BY 4.0.
Comparați grupările albastre dense cu marginile mai puțin aglomerate. Contururile individuale sunt mai ușor de urmărit acolo unde obiectele se suprapun mai puțin. Numele Candida provine din documentația sursei, nu dintr-o identificare a speciei efectuată pe această fotografie. Această planșă nu oferă nici un rezultat privind viabilitatea. Testele de viabilitate și respirație la levuri necesită propriile condiții, controale și interpretări.
Interpretarea corectă a scării
Aceste planșe permit comparații vizuale, nu măsurători în micrometri sau comparații ale dimensiunilor absolute ale celulelor între planșe. Mărirea raportată nu poate compensa lipsa calibrării camerei. Modificarea dimensiunii de afișare a unei imagini îi schimbă mărirea aparentă.
Pentru propriile imagini, stabiliți o calibrare pentru măsurători folosind un etalon cunoscut și configurația optică relevantă. Ghidul Nikon de micrometrie explică modul în care o lamă micrometrică transformă diviziunile arbitrare ale imaginii sau ale reticulului în lungimi fizice. Notați obiectivul, configurația camerei și calibrarea și adăugați o bară de scară pe baza acestor date. Nu deduceți o bară de scară din dimensiunea medie a celulelor indicată într-un manual.
Corespunde flaconul metodei?
Un flacon etichetat „albastru de metilen” nu reprezintă o specificație completă de laborator. Verificați concentrația și unitățile, solventul, ingredientele suplimentare, utilizarea prevăzută, documentația lotului și instrucțiunile. Fișa cu date de securitate a unui reactiv descrie pericolele; instrucțiunile metodei stabilesc cum trebuie utilizat pentru preparatul prevăzut.
Un exemplu concret este soluția de albastru de metilen Löffler de la Merck. Producătorul o identifică drept reactiv pentru microscopie și îi descrie rolul de contracolorant în colorarea pentru evidențierea microorganismelor acidorezistente. Inflamabilitatea menționată arată, de asemenea, de ce descrierea „un lichid albastru” nu oferă suficiente informații pentru planificarea manipulării sau a încălzirii. Aceste proprietăți se aplică formulării respective, nu automat fiecărei soluții apoase de albastru de metilen.
La fel, agarul cu eozină și albastru de metilen este un mediu de cultură cu o formulare specifică. Nu este un colorant pentru lame obținut prin adăugarea de albastru de metilen simplu într-o probă. Pentru un alt obiectiv de examinare microscopică, comparați alternativele la albastrul de metilen pentru microscopie.
Pentru un kit de microscopie pentru începători, porniți de la metoda didactică documentată a acestuia, lame preparate cunoscute și reactivul specificat. Dacă un flacon și-a pierdut eticheta sau compoziția sa nu poate fi stabilită, înlocuiți-l cu reactivul adecvat, documentat. Folosiți protecție oculară și urmați instrucțiunile de manipulare furnizate pentru formularea efectivă. Materialul uman și probele de mediu necunoscute necesită procedurile de manipulare și eliminare a probelor din laboratorul didactic; colorarea nu înlocuiește aceste proceduri.
Consemnați observația înaintea concluziei
„Obiecte ovale albastre grupate” este o descriere justificabilă a unei imagini. „O anumită infecție” necesită dovezi pe care imaginea nu le-a furnizat. Consemnați separat în caiet proveniența probei, prepararea, reacția de colorare și metoda de identificare. Această distincție face utilă o imagine simplă realizată la clasă și împiedică atribuirea unei afirmații pe care o microfotografie atractivă nu o poate susține.