Porque é que a absorção do azul de metileno muda com a concentração

Pegue numa única garrafa de solução-mãe de azul de metileno e encha dois copos. Encha o primeiro diretamente a partir da solução-mãe e o segundo com uma diluição de dez vezes. O segundo copo é mais pálido, como seria de esperar. Observe com atenção e verá que há outra diferença. A tonalidade mudou. Uma solução aproxima-se de um azul-celeste límpido e a outra de um azul com tonalidade violeta. A diluição fez mais do que reduzir a intensidade. Alterou qual das espécies químicas é responsável pela maior parte da absorção.

O conceito por detrás desta mudança é simples. O azul de metileno dissolvido não corresponde a uma única espécie. O catião individual do corante, denominado monómero, pode empilhar-se face a face com um segundo catião para formar um dímero, e os dímeros podem formar agregados maiores. Cada forma tem o seu próprio espectro de absorção. O que um espectrofotómetro regista é a soma de todas as espécies presentes na mistura naquela cuvete, sob aquelas condições. Se a mistura mudar, o espectro desloca-se, mesmo quando o teor total de corante segue uma proporção de diluição linear.

O monómero e o dímero são absorventes diferentes

Imagine o monómero como uma carta plana com uma carga positiva distribuída pelo seu sistema de anéis. Duas dessas cartas podem ficar sobrepostas face a face. As cargas positivas repelem-se, mas as superfícies aromáticas planas atraem-se através de interações de empilhamento, enquanto a água circundante e os contra-iões atenuam a repulsão. O resultado é um par ligado com estados eletrónicos partilhados. As suas transições permitidas situam-se a uma energia superior à da transição do monómero, pelo que a banda do dímero surge num comprimento de onda mais curto do que a banda do monómero, enquanto agregados maiores contribuem ainda mais para o lado azul sob a forma de um ombro.

A concentrações muito baixas em água limpa, predominam os monómeros e predomina a banda de comprimento de onda longo. À medida que a concentração total aumenta, a forma emparelhada representa uma fração crescente e a banda de comprimento de onda mais curto aumenta em relação à primeira. A razão entre as duas bandas indica, portanto, a composição da mistura, e não diretamente a concentração total. Uma leitura num único comprimento de onda não permite separar as duas sem assumir qual das formas está presente.

É por isso que os espectros de referência têm sempre de estar associados às respetivas condições. A referência espectral do azul de metileno apresenta as posições das bandas juntamente com o solvente, o fundo salino, o pH, a temperatura e o intervalo de concentração que lhes deram origem. Indicar um pico sem essas condições deixa o valor insuficientemente especificado. Dois laboratórios podem ambos estar corretos ao obter espectros diferentes para o mesmo corante, porque mediram misturas diferentes.

O que desloca o equilíbrio

A concentração é o principal fator. A formação de um dímero exige que dois monómeros se encontrem, pelo que a sua fração aumenta mais depressa do que linearmente com o corante total. As constantes de dimerização aquosa publicadas situam-se na ordem dos milhares por molar perto da temperatura ambiente, pelo que a fração de dímero aumenta acentuadamente ao longo do intervalo micromolar. Um ajuste global abrangente, desde corante micromolar até millimolar, encontrou uma contribuição não nula de tetrâmero já abaixo de 34 micromolar, o que aconselha cautela ao confiar num ajuste estrito de duas espécies a dezenas de micromolar. As frações exatas dependem do meio, razão pela qual este artigo apresenta tendências em vez de uma tabela de conversão universal.

O sal é o segundo fator. Os iões dissolvidos atenuam a repulsão entre dois catiões, pelo que a adição de cloreto de sódio e eletrólitos semelhantes desloca a mistura para dímeros e agregados à mesma concentração de corante. Este efeito é visível em estudos da agregação do azul de metileno em meios salinos e aquosos, nos quais foi medido corante desde cerca de 1 micromolar até 3.4 millimolar com concentrações de cloreto de sódio entre 0 e 0.15 molar. Nesse ajuste, a fração de tetrâmero atingiu cerca de 0.93 no extremo de elevada concentração de corante e sal. Por conseguinte, um espectro registado em água e outro registado em solução salina fisiológica não são padrões intercambiáveis.

A temperatura atua no sentido oposto. O empilhamento liberta água ligada e é contrariado pelo movimento térmico, pelo que aquecer uma solução normalmente dissocia alguns dímeros de volta em monómeros, enquanto o arrefecimento favorece a associação. A entalpia de dissociação ajustada é negativa, cerca de menos 30 kilojoules per mole entre 282 e 333 kelvin, o que confirma uma associação exotérmica. Uma amostra fria medida imediatamente depois de sair do frigorífico pode parecer mais agregada do que a mesma amostra depois de atingir o equilíbrio à temperatura ambiente.

O solvente estabelece a linha de base. A água, com o seu forte efeito hidrofóbico, incentiva os catiões planos do corante a empilharem-se. Álcoois como o etanol e o metanol solvatam melhor os anéis e desfazem os agregados, pelo que a mesma concentração de corante apresenta um caráter mais monomérico em etanol do que em água. Os cossolventes apróticos produzem o mesmo efeito: em misturas de água e DMSO a 293 kelvin, a adição de DMSO suprimiu a dimerização, o que aponta para a estrutura da água como um dos fatores que promove o empilhamento. Os tensioativos exigem atenção em ambos os sentidos. Acima da respetiva concentração micelar crítica, as micelas podem solubilizar individualmente os monómeros e restaurar um espectro semelhante ao do monómero. Abaixo desse ponto, um tensioativo com carga oposta pode, pelo contrário, promover o empilhamento: com 100 micromolar de corante, a polimerização induzida por SDS atingiu o máximo perto de 4 millimolar de SDS, aproximadamente metade do ponto de formação de micelas, antes de ocorrer redistribuição a níveis mais elevados de tensioativo. O trabalho sobre os efeitos do solvente do corante e dos meios organizados nos espectros do azul de metileno ilustra até que ponto o ambiente molecular imediato, e não apenas a concentração global, determina as bandas observadas.

O pH é relevante sobretudo nos extremos. Ao longo do intervalo próximo da neutralidade utilizado na maioria dos trabalhos laboratoriais, o azul de metileno mantém-se na sua conhecida forma catiónica azul, e a agregação domina o comportamento espectral. Ácido ou base fortes, química redox que produza a forma leuco incolor, ou ligação a proteínas e partículas introduzem, cada um, estados para além do par monómero-dímero. Quando um espectro muda depois da adição de um tampão, verifique a composição do tampão quanto a sais e componentes de ligação antes de atribuir tudo apenas ao pH. A referência sobre química e protonação mantém estas questões de identidade separadas da questão de agregação tratada aqui.

Porque é que a linha reta de Beer-Lambert se curva

A relação de Beer-Lambert estabelece que a absorvância é igual à absortividade multiplicada pela concentração e pelo comprimento do percurso ótico. É uma lei de contagem. Parte do princípio de que os objetos contados permanecem idênticos à medida que o seu número muda: uma única espécie absorvente, espectro fixo, ausência de alterações químicas com a concentração, luz de medição monocromática, ausência de dispersão ou reemissão e luz que percorre efetivamente o percurso indicado.

A agregação viola o primeiro pressuposto. Formalmente, a absorvância total continua a ser uma soma das várias espécies: comprimento do percurso ótico multiplicado pela absortividade de cada uma e pela respetiva concentração da espécie. Cada espécie obedece à lei. A mistura não, porque as concentrações das espécies são funções não lineares da quantidade total de corante. Uma curva de calibração da absorvância na banda do monómero em função do corante total começa, portanto, por ser linear no limite diluído e curva-se para baixo à medida que a concentração aumenta, porque cada incremento adicional contém proporcionalmente menos monómero. Uma curva medida na banda do dímero curva-se no sentido oposto. Os trabalhos sobre agregação identificam precisamente este mecanismo como a origem dos desvios observados à lei de Lambert-Beer. Ajustar uma linha reta à região curva e extrapolá-la é o erro habitual. A linha só é válida dentro do intervalo e da matriz em que foi construída.

A diluição cria uma armadilha relacionada. Diluir uma solução-mãe concentrada para entrar no intervalo do instrumento não preserva a proporção entre espécies. A cuvete diluída reequilibra-se no sentido do monómero, pelo que o seu espectro descreve corretamente a amostra diluída e descreve incorretamente a solução-mãe. Calcular retroativamente o espectro da solução-mãe aumentando proporcionalmente as absorvâncias só recupera a estimativa do teor total se a calibração já tiver em conta esta mudança. Nunca recupera a forma original das bandas. Quem compara o espectro de um concentrado com uma referência diluída está a comparar duas misturas diferentes.

O comprimento do percurso ótico faz parte do resultado

A absorvância aumenta proporcionalmente à distância percorrida pela luz através da amostra. Uma cuvete de 10 mm produz dez vezes a absorvância de uma cuvete de 1 mm contendo a mesma solução. Essa proporcionalidade só é exata para a mesma solução, e a agregação torna essa condição essencial.

Na prática, o comprimento do percurso ótico é uma ferramenta para permanecer dentro do intervalo válido. Um percurso longo proporciona sensibilidade para soluções diluídas, predominantemente monoméricas. Um percurso curto mantém uma amostra concentrada dentro da escala sem exigir uma grande diluição que redefiniria o equilíbrio. O programa de agregação que está na origem dos valores acima fez exatamente isso: células de 1 centimeter para corante entre 1.1 e 34 micromolar e células de 0.01 centimeter para concentrações entre 94 micromolar e 3.4 millimolar. Pedestais de microvolume e leitores de placas introduzem a sua própria geometria, com percursos curtos e por vezes variáveis, além de superfícies às quais o corante catiónico se pode adsorver. Indique o percurso juntamente com o valor, da mesma forma que a referência espectral indica o solvente e o sal. Uma absorvância sem comprimento de percurso ótico não é um resultado. É um rumor.

A disciplina de medição decorre do mecanismo. Deixe as amostras equilibrar até à mesma temperatura antes da leitura. Utilize o mesmo tipo e orientação de cuvete, brancos correspondentes com o mesmo fundo salino e tampão, e material de vidro limpo, porque o azul de metileno se adsorve ao vidro e ao plástico, e uma cuvete manchada conserva memória da última amostra concentrada. Faça a leitura pouco depois da preparação quando a cinética de agregação for relevante e construa cada curva de calibração na mesma matriz e com o mesmo comprimento do percurso ótico das amostras desconhecidas. Para verificações visuais, lembre-se de que o olho é um espectrómetro fraco. Saber se a cor da solução pode estabelecer a pureza é uma questão diferente, cuja resposta é negativa, e as mudanças de tonalidade causadas pela agregação são uma das razões.

Um diagrama para manter junto do instrumento

A figura abaixo condensa o artigo numa única referência de bancada. Três soluções contêm o mesmo corante, mas diferem na concentração total e no fundo salino. Os respetivos espectros esquemáticos mostram a banda do monómero de comprimento de onda longo a perder importância para a banda do dímero de comprimento de onda mais curto à medida que o empilhamento aumenta. As condições estão impressas na figura porque, sem elas, as curvas não podem ser reutilizadas. Para posições de bandas medidas em condições especificadas, utilize a referência espectral. Para compreender como o corante entra nas células depois de estar em solução, consulte entrada celular por redução e partição. Para saber de que forma a dose de luz e a geometria também condicionam as leituras fotoquímicas, consulte exposição à luz e geometria de medição.

A regra essencial tem duas partes. O espectro identifica a mistura presente na cuvete nas condições indicadas. Apenas uma calibração construída nessas mesmas condições converte uma absorvância numa concentração total. :::