Azul de metileno, tau e amiloide: porque diferem os mecanismos de depuração proteica

Pergunte o que o azul de metileno faz às proteínas da doença de Alzheimer e ouvirá uma resposta confiante onde deveria ouvir três respostas condicionadas. Num tubo de ensaio, interfere com a ligação da tau a si própria. Num modelo de ratinho, reduz o amiloide solúvel sem alterar a tau. Noutro, reduz a atividade da enzima que produz amiloide desde o início. Cada um destes resultados é real. Nenhum conta a história completa, e não ocorrem todos no mesmo animal ao mesmo tempo. Este artigo separa os três, para que um resultado de uma experiência deixe de ser citado como prova de outra.

Os leitores que pretendam uma visão mais abrangente de como o azul de metileno atua no interior das células devem começar aí. Os leitores que queiram saber se alguma destas observações ajudou doentes devem consultar o registo clínico na doença de Alzheimer, que é onde pertencem os resultados dos ensaios em humanos. Nada neste artigo repete esse registo.

A descoberta sobre a tau pertence aos ensaios de agregação

A mais antiga das três histórias vem de trabalhos sem células sobre a tau, a proteína que forma emaranhados neurofibrilares. No ensaio de ligação tau-tau, fragmentos de tau organizam-se em filamentos helicoidais emparelhados, e os corantes fenotiazínicos, incluindo o azul de metileno, bloqueiam essa montagem em concentrações micromolares baixas. Trabalhos bioquímicos posteriores forneceram uma explicação química: o corante oxida resíduos de cisteína na tau, o que estabiliza a forma monomérica e suprime as fibrilas que, de outro modo, cresceriam. As concentrações inibitórias comunicadas para a agregação da tau situam-se aproximadamente entre valores micromolares de um dígito e algumas dezenas, um intervalo relevante para tudo o que se segue.

Note-se o tipo de afirmação em causa. Nada diz sobre a produção de tau, a fosforilação da tau num cérebro vivo ou a depuração da tau. Diz que, em condições definidas num tubo, o corante oxidado impede que a tau se empilhe. É um resultado preciso, restrito e útil. O problema começa quando é alargado a uma afirmação geral de que o azul de metileno elimina a patologia da tau, porque os dados em animais não sustentam essa versão.

A descoberta sobre o proteassoma pertence aos ratinhos 3xTg-AD e separou o amiloide da tau

A experiência com a separação mais clara entre parâmetros é um estudo dietético de 16 semanas em ratinhos portadores de três mutações de Alzheimer. Os animais consumiram ração contendo azul de metileno a partir dos seis meses de idade, e os investigadores mediram três coisas simultaneamente: o proteassoma, os níveis de amiloide e a tau.

O proteassoma mudou. A atividade semelhante à quimotripsina aumentou cerca de um quarto e a atividade semelhante à tripsina cerca de metade, enquanto a terceira atividade catalítica não se alterou significativamente. O beta-amiloide solúvel 40 e 42 diminuiu, em ambos os casos, cerca de um quarto. Os autores interpretaram isto como um aumento da depuração, e não como uma redução da produção, porque a proteína precursora e os seus fragmentos de processamento não se alteraram, e a aprendizagem e a memória melhoraram no ensaio de prova do labirinto aquático.

Depois surgiram as dissociações. O amiloide insolúvel não se alterou. A coloração das placas não se alterou. A tau humana total e a fosfo-tau na treonina 181 não se alteraram, e a localização anómala da tau também não se alterou. As medidas mitocondriais também não se alteraram: não houve efeito significativo na atividade da citocromo-c oxidase, na proteína oxidase ou no ATP. Assim, neste modelo, com este regime, o azul de metileno aumentou duas das três atividades do proteassoma, reduziu o amiloide solúvel, recuperou uma medida comportamental e deixou inalterados os parâmetros da tau, o amiloide insolúvel e os parâmetros mitocondriais testados.

Uma ressalva reforça este ponto, em vez de o enfraquecer. Estes ratinhos ainda não tinham desenvolvido agregados de tau na idade testada, pelo que a experiência não pode demonstrar que o azul de metileno não funciona contra os emaranhados de tau. Mostra que o amiloide solúvel pode diminuir sem que os parâmetros medidos da tau se alterem, precisamente o tipo de resultado em que uma proteína muda e outra não que este tema exige. Se chegou aqui a acreditar que a ativação do proteassoma pelo azul de metileno elimina simultaneamente as duas proteínas características, este estudo é a correção.

A descoberta sobre a produção de amiloide pertence a ratinhos PSAPP envelhecidos e contradiz o mecanismo anterior

Um grupo diferente, um modelo diferente e a explicação a montante oposta. Num estudo de três meses por gavagem em ratinhos PSAPP com 15 meses de idade, uma dose oral diária de 3 mg/kg reduziu a carga de placas nas várias regiões cerebrais em cerca de um terço a metade e diminuiu várias frações de amiloide, incluindo oligómeros medidos por um ensaio específico. Mas aqui o mecanismo proposto foi a redução da produção, não uma depuração mais rápida: a proteína BACE1 no cérebro diminuiu, o seu produto C99 diminuiu e o RNA mensageiro não se alterou, o que aponta para um efeito ao nível da proteína e não para uma menor expressão génica.

O trabalho em células reforçou esta interpretação. Num ensaio sem células com enzima recombinante, o azul de metileno inibiu diretamente a BACE1 e, em células de ovário de hamster que expressavam a proteína precursora de amiloide humana, o amiloide 40 e 42 secretado diminuiu em concentrações tão baixas como 1.56 micromolar, enquanto o próprio precursor permaneceu inalterado. Compare-se isto com o estudo anterior, em que os fragmentos de processamento do precursor permaneceram inalterados e a depuração foi apontada como explicação. Ambos não podem descrever o mesmo mecanismo universal, porque os modelos, idades, doses, vias de administração e durações são diferentes. É precisamente esse o ponto. Os efeitos do azul de metileno sobre o amiloide passam pela produção num contexto e pela depuração noutro, e citar qualquer um deles sem o respetivo contexto induz em erro.

Uma química, vários alvos: a ponte da oxidação da cisteína

Uma terceira linha de investigação explica como uma única química redox pode surgir em histórias não relacionadas sobre proteínas. Num estudo bioquímico sobre a inibição de caspases, o azul de metileno inativou a caspase-6 ao oxidar a sua cisteína catalítica para ácido sulfénico, algo confirmado por espectrometria de massa, com uma concentração semimáxima próxima de 10.6 micromolar. A caspase-3 foi inibida a uma concentração semelhante. Os autores relacionaram explicitamente este resultado com a literatura sobre a tau: a mesma química de oxidação da cisteína proposta para manter a tau monomérica pode desativar uma protease de cisteína, e as concentrações eficazes sobrepõem-se.

Isto é elegante e também constitui um aviso. Uma molécula redox-ativa que oxida cisteínas expostas terá mais do que um alvo em qualquer concentração ativa. A história da desagregação da tau, a história das caspases e possivelmente outras partilham um verbo químico aplicado a substantivos diferentes. Esse verbo comum não torna os resultados intercambiáveis. Significa que a dose e o contexto determinam qual o alvo relevante, e que a administração crónica dirigida a um processo dependente de cisteína pode afetar outros, uma consideração que os autores do estudo sobre caspases levantaram diretamente. Questões relacionadas sobre como a química redox do azul de metileno seleciona os seus alvos, o que a ativação do proteassoma implica para outras proteínas agregadas e se a administração prolongada altera o perfil de alvos merecem, cada uma, uma análise própria.

Mecanismo por parâmetro: qual descoberta pertence a qual modelo

Leia a tabela linha a linha e a conclusão é clara. Nenhuma linha se altera em todas as colunas. O resultado mais forte sobre a produção de amiloide vem do estudo que nunca testou o proteassoma. O resultado mais forte sobre o proteassoma vem do estudo em que o processamento do precursor não se alterou. O resultado sobre a tau existe sobretudo em tubos e numa química partilhada com enzimas fora do alvo. Quem funde estas colunas numa única afirmação — de que o azul de metileno elimina proteínas patológicas enquanto classe — está a escrever uma revisão de uma experiência que nunca foi realizada.

Essa disciplina também se aplica aos doentes. Saber se estes mecanismos, em conjunto, se traduzem em benefício clínico é uma questão separada, com os seus próprios ensaios e as suas próprias conclusões, e é respondida em a evidência clínica na doença de Alzheimer, não aqui.