Azul de metileno na lesão cerebral: compreender a evidência pré-clínica

Uma pancada na cabeça, uma artéria bloqueada e uma doença neurodegenerativa de progressão lenta podem terminar com o mesmo problema: o cérebro deixa de ter a energia necessária para funcionar. É esse desfecho comum que explica por que motivo um composto surge repetidamente nas três literaturas. Mas um desfecho comum não significa um conceito comum. Um tratamento administrado antes de uma lesão, um tratamento administrado na hora seguinte e um tratamento avaliado meses mais tarde testam ideias diferentes, mesmo quando a seringa contém o mesmo líquido azul.

Este artigo acompanha a vertente dessa literatura dedicada às lesões. Analisa o que significa o azul de metileno na lesão cerebral em experiências com animais, distingue a lesão traumática do AVC e da neurodegeneração crónica e mostra por que motivo o momento da administração explica a maioria das diferenças entre estudos.

Três lesões, uma falha energética

O mecanismo que liga estes modelos encontra-se nas mitocôndrias. Normalmente, os eletrões percorrem a cadeia de transporte de eletrões para produzir ATP, e uma cadeia saudável mantém as espécies reativas de oxigénio sob controlo. Após uma lesão, partes da cadeia deixam de funcionar corretamente, a produção de ATP diminui e a produção de radicais livres aumenta. A revisão de 2018 na Molecular Neurobiology descreve o azul de metileno como um transportador alternativo de eletrões: aceita eletrões do NADH e transfere-os para o citocromo c, o que aumenta a atividade do complexo IV e restabelece a síntese de ATP mesmo quando a parte inicial da cadeia está comprometida.

Os números relatados são concretos. Em preparações celulares e de cortes de tecido, a atividade do complexo IV aumentou 30 a 100 por cento, enquanto o consumo de oxigénio aumentou em paralelo, indicando que os eletrões adicionais realizaram trabalho útil em vez de escaparem sob a forma de radicais. Num modelo de AVC em ratos, a produção de ATP na região afetada era cerca de 30 por cento superior 24 horas após o tratamento em comparação com animais não tratados. A revisão de 2022 na Biochemistry (Moscow) acrescenta as consequências a jusante: menos stress oxidativo, menos neuroinflamação, menos apoptose, além de efeitos sobre a monoamina oxidase, a sintase do óxido nítrico, a biogénese mitocondrial, a autofagia e a agregação de proteínas com dobramento incorreto.

O conceito é, portanto, simples. A lesão estrangula a via normal dos eletrões, e o azul de metileno oferece um desvio. Tudo o que se segue depende do tipo de lesão, do momento da administração e da forma como o resultado é medido.

A lesão traumática não é um AVC

Num modelo de lesão cerebral traumática, a força surge toda de uma vez. O dano primário é mecânico: o tecido rompe-se, os vasos sofrem rutura e a barreira hematoencefálica abre-se em poucos minutos. Aquilo em que o azul de metileno pode plausivelmente interferir é a onda secundária que se segue ao longo de horas e dias, à medida que as mitocôndrias no tecido sobrevivente falham, a inflamação se propaga e o edema aumenta. Os parâmetros avaliados nestes estudos refletem essa sequência: volume da lesão, conteúdo de água no cérebro, sobrevivência neuronal junto à zona de impacto e, mais tarde, comportamentos como a recuperação motora ou a aprendizagem em labirinto.

Num modelo de AVC ou de isquemia global, a agressão assume a forma oposta. O fluxo sanguíneo cessa, a falha energética surge em poucos minutos e o restabelecimento do fluxo provoca a sua própria lesão de reperfusão. Aqui, a administração é sincronizada com o evento vascular, muitas vezes poucos minutos após a oclusão ou a reperfusão, e os parâmetros quantificam o destino agudo do tecido ao longo de horas até um ou dois dias: tamanho do enfarte, fluxo sanguíneo e recuperação funcional precoce. Um padrão presente na literatura sobre AVC é o pré-tratamento, com os animais a receberem a substância antes da oclusão vascular, o que testa prevenção de uma forma que nenhuma experiência de traumatismo craniano pode reproduzir eticamente em seres humanos.

Os resultados relativos ao AVC são os mais fortes na literatura sobre lesões e incluem o resultado nulo mais claro. Ratos que receberam azul de metileno durante a reperfusão após uma hora de oclusão da artéria cerebral média terminaram com enfartes 30 por cento menores no dia 2, tendo sido preservada uma maior parte do núcleo ameaçado e da penumbra (Shen, 2013). Um estudo de oclusão permanente encontrou uma progressão mais lenta do tecido ameaçado para enfarte, mas nenhuma redução do volume final do enfarte às 24 horas em nenhuma das doses testadas (Rodriguez, 2014). Um terceiro estudo de oclusão reduziu o tamanho do enfarte aproximadamente para metade com a dose intermédia e documentou diretamente a ultraestrutura mitocondrial e a mitofagia no cérebro isquémico, ao mesmo tempo que relatou o pormenor contraintuitivo de a apoptose medida ter aumentado à medida que a necrose diminuiu (Di, 2015). E, na isquemia global, uma perfusão contínua de baixa dose restabeleceu a atividade da citocromo c oxidase, os níveis de ATP e o potencial da membrana mitocondrial na vulnerável região hipocampal CA1, preservou esses neurónios e protegeu a memória espacial (Lu, 2016). Vale a pena destacar essa medição em CA1: dados diretos de ATP e da cadeia respiratória obtidos no interior de um cérebro lesionado, algo que a literatura sobre TBI, na sua maioria, infere em vez de medir.

A neurodegeneração crónica difere de ambas. Os modelos de doença de Alzheimer, Parkinson e Huntington administram substâncias aos animais durante semanas ou meses e medem agregação proteica, processamento da dopamina ou declínio cognitivo gradual. Esses parâmetros têm muito pouco em comum com uma lesão medida dias após um impacto. Os leitores que transportam um resultado de uma coluna para outra estão a deslocar uma conclusão através de uma fronteira que as experiências nunca atravessaram. O nosso guia sobre a literatura da neurodegeneração mantém esses estudos de longa duração no seu próprio enquadramento, e a comparação com a evidência exclusiva de AVC separa em detalhe os desenhos experimentais de bloqueio vascular dos desenhos de impacto.

O que os modelos de TBI realmente fizeram

Não foi publicado qualquer ensaio em seres humanos sobre azul de metileno na lesão cerebral traumática. Todo o registo relativo a TBI provém de estudos em animais, sobretudo ratos e ratinhos, e concentra-se num pequeno conjunto de experiências que vale a pena identificar, porque os seus detalhes diferem de formas que os resumos tendem a apagar.

O primeiro estudo de impacto cortical controlado administrou a ratos 1 mg/kg por via intravenosa uma hora após um impacto ligeiro e, depois, 0.5 mg/kg às três horas (Watts, 2014). O volume da lesão na RM permaneceu inferior nos animais tratados durante duas semanas de acompanhamento. As falhas de apoio num teste de marcha diminuíram significativamente nos dias 1, 2 e 7, mas não no dia 14. Ao microscópio, no dia 14, foram contados 270 neurónios em degeneração no córtex lesionado contra 368 por campo, e 41 casos de coloração de Nissl anormal contra 73. Por outras palavras, houve proteção precoce, enquanto a vantagem comportamental desapareceu até à segunda semana.

Um desenho de lesão difusa utilizou percussão de fluido na linha média em ratinhos e uma única dose intravenosa de 2 mg/kg no espaço de meia hora (Fenn, 2015). Os animais tratados apresentaram expressão génica inflamatória mais moderada, menos microglia inflamatória, menor edema aparente e ausência de comportamento do tipo depressivo no dia 7. Os resultados nulos são igualmente importantes: a própria lesão aumentou apenas modestamente o conteúdo de água no cérebro, e o azul de metileno não reverteu a perda de peso corporal nem o défice de coordenação motora. Um efeito anti-inflamatório não equivale a proteção completa.

Dois estudos em ratinhos utilizaram o mesmo esquema, 1 mg/kg a uma hora, 0.5 mg/kg às seis horas e, depois, administração diária durante três dias, e alargaram a análise do mecanismo. Num modelo de impacto cortical, o tratamento reduziu o volume da lesão às 24 horas, 72 horas e no dia 14, preservando simultaneamente neurónios e aumentando os marcadores de autofagia (Zhao, 2016). Num modelo de percussão de fluido, reduziu a apoptose neuronal, reforçou uma barreira hematoencefálica permeável e melhorou as pontuações neurológicas ao longo de duas semanas (Shen, 2019). No entanto, o conteúdo de água no cérebro não apresentou diferenças às 72 horas no estudo de Zhao, e o desempenho no rotarod também não apresentou diferenças nos dias 1 e 3 no estudo de Shen. Os parâmetros relativos à lesão e à sobrevivência celular alteraram-se; o edema e os parâmetros motores precoces nem sempre acompanharam essas alterações.

O caso mais relevante em termos de momento da administração é a experiência com administração tardia (Watts, 2016). Utilizando o mesmo modelo de impacto, a primeira dose só foi administrada 24 horas após a lesão. No dia 2, o grupo de administração tardia apresentou reduções da lesão comparáveis às observadas nos animais tratados nas primeiras horas, e essa redução persistiu nos dias 7 e 14. O sinal comportamental foi mais fraco: a melhoria das falhas de apoio no grupo de administração tardia foi uma tendência sem significância estatística. Um laboratório, um modelo, uma janela de 24 horas. Isto constitui evidência real de que a janela se prolonga para além das primeiras horas, mas constitui também toda a evidência existente para essa proposição. Importa notar a armadilha da palavra tardia noutros trabalhos: uma série russa com um título centrado na neuroproteção tardia administrou a substância aos 30 minutos e utilizou tardia para significar resultados duradouros, não início tardio do tratamento.

Um estudo menor de lesão focal em ratos completa o quadro temporal a partir da direção oposta: tanto a administração imediatamente antes da lesão como a administração 30 minutos depois reduziram a disfunção dos membros (Stelmashook, 2019). O pré-tratamento funciona em laboratório precisamente porque o laboratório agenda a lesão.

A disciplina da dose é importante neste contexto. As revisões descrevem as doses baixas como estimuladoras da respiração mitocondrial e as doses elevadas como inibidoras, a mesma forma bifásica observada em toda a farmacologia do azul de metileno. Por isso, os resultados não podem ser interpretados como mais azul, mais recuperação. Cada estudo testa um ponto numa curva. A explicação da resposta à dose acompanha essa curva em vários modelos, e o perfil de segurança e efeitos secundários aborda o que acontece com doses mais elevadas.

Leia a tabela da esquerda para a direita: o mesmo composto, três relógios diferentes. A prevenção pertence à linha do meio, o tratamento imediato às duas primeiras, e os resultados tardios à primeira e à terceira.

Prevenção, tratamento imediato, resultados tardios

A prevenção é a alegação mais fácil de interpretar incorretamente. Nos modelos de isquemia, os animais que recebem a substância antes da oclusão vascular apresentam melhores resultados, e esse resultado é por vezes citado como se o azul de metileno protegesse qualquer cérebro contra qualquer agressão futura. Não demonstra tal coisa. Mostra que mitocôndrias preparadas com uma via alternativa de eletrões toleram melhor uma perda de fluxo sanguíneo programada. Ninguém agenda um traumatismo craniano.

O tratamento imediato é onde se concentra a evidência relativa a TBI. A administração nas horas seguintes ao impacto visa a cascata de lesão secundária enquanto esta ainda está a decorrer: falha energética, stress oxidativo, inflamação, edema. As melhorias observadas aqui nos parâmetros de lesão e edema são efeitos reais do tratamento, mas representam o tratamento de um processo, não a reversão de tecido rompido.

Os resultados tardios constituem o terceiro conceito. O comportamento medido semanas após a lesão, ou o processamento de proteínas medido meses depois num modelo degenerativo, responde à questão de saber se a proteção inicial persistiu ou se processos lentos mudaram de trajetória. Uma lesão menor às 24 horas, uma tendência comportamental sem significância após uma primeira dose administrada com 24 horas de atraso e uma melhoria num labirinto após meses de administração crónica são três alegações diferentes, com três exigências de prova diferentes, e apenas a primeira ultrapassa atualmente esse limiar mais do que uma vez.

O que esta evidência não pode demonstrar

Todos os resultados acima têm a mesma limitação. As mitocôndrias dos roedores respondem ao azul de metileno de formas que as mitocôndrias humanas poderão partilhar, mas um rato que recebe uma dose intravenosa poucos minutos após um impacto calibrado não é equivalente a uma pessoa que chega a um serviço de urgência horas depois de uma queda. A anestesia, a gravidade controlada da lesão, os animais jovens e saudáveis e o curto período de acompanhamento limitam todos a possibilidade de extrapolação. Não existe qualquer estudo sobre azul de metileno em lesões por explosão, pelo que o tipo de lesão mais relevante para leitores militares é precisamente aquele para o qual existe menos evidência.

Também não existe qualquer conversão de dose aplicável. A literatura em animais utiliza vias intravenosa e intraperitoneal em doses escolhidas para controlo experimental, não as gotas orais vendidas a retalho. Nada nestes estudos estabelece um regime para seres humanos, e nenhum deles testa azul de metileno em conjunto com os cuidados padrão para traumatismo craniano.

Assim, o resumo rigoroso cabe num parágrafo. Em roedores, o azul de metileno administrado em torno do momento de uma lesão cerebral traumática ou isquémica preserva a produção de energia mitocondrial, e essa preservação é seguida por lesões menores e melhores pontuações de recuperação. Um estudo de impacto manteve parte do efeito sobre a lesão quando a primeira dose foi adiada 24 horas. Não foi testado se algum destes efeitos ocorre em cérebros humanos lesionados, e as literaturas sobre TBI e AVC testam momentos de administração diferentes relativamente a parâmetros diferentes. Quem apresentar certezas com base nesta evidência está a acrescentar um ingrediente que nunca esteve presente nas experiências. :::