Azul de metileno e esclerose múltipla: o que foi testado na investigação em animais

Pesquise azul de metileno para EM e encontrará artigos que parecem responder à mesma pergunta. Não respondem. Um artigo administrou azul de metileno a ratinhos doentes como tratamento. O outro nunca tratou qualquer animal com ele. Usou azul de metileno apenas como corante azul em cortes finos da medula espinal para que um patologista pudesse observar a mielina ao microscópio.

Este é o conceito subjacente a todo o artigo. O corante tem dois papéis na biologia e não partilham nada além do frasco. Como candidato a fármaco, é administrado a um animal vivo e a questão é saber se a doença se altera. Como corante, é aplicado a tecido morto e fixado após a experiência e a questão é saber qual era o aspeto do tecido. Se não fizer esta distinção, interpretará uma secção de métodos de patologia como se fosse um resultado de tratamento.

O que é a EAE, em termos simples

A encefalomielite autoimune experimental, normalmente abreviada para EAE, é o modelo animal padrão para determinados aspetos da esclerose múltipla. Um investigador imuniza um ratinho suscetível com um fragmento de uma proteína da mielina e um adjuvante forte. O sistema imunitário passa então a atacar o sistema nervoso central do próprio animal. O ratinho desenvolve fraqueza ascendente, que é fácil de classificar numa escala de 0 a 5, desde cauda flácida até paralisia dos membros posteriores.

Esta facilidade de classificação explica por que motivo a EAE é popular e também por que pode induzir em erro. A EM humana surge espontaneamente, envolve um conjunto mais amplo e menos definido de alvos e produz sintomas óticos, sensoriais, cognitivos, cerebelares e motores em cursos recidivantes ou progressivos. A EAE reproduz mecanismos selecionados, como inflamação, desmielinização e lesão axonal, em condições controladas. Não reproduz a EM em miniatura. Os leitores que pretendam compreender o enquadramento geral podem rever como se pensa que o azul de metileno atua a nível celular antes de avaliar qualquer alegação específica sobre uma doença.

Os dois artigos abaixo também utilizaram antigénios de EAE diferentes, o que é relevante. O estudo de tratamento induziu a doença com MOG35-55, um péptido curto da glicoproteína oligodendrocitária da mielina. O estudo de patologia induziu a doença com MP4, uma fusão de segmentos de proteína básica da mielina e proteína proteolipídica. As escolhas da estirpe e do antigénio alteram os locais onde surgem as lesões e a forma como a inflamação se comporta, pelo que os dois estudos não são duas repetições da mesma experiência.

O mapa: do modelo à pergunta e aos limites

Mantenha esta tabela à mão. É a referência original deste artigo. Cada linha indica que questão clínica o modelo pode abordar, o que foi efetivamente medido e onde termina a possibilidade de translação.

Quem quiser verificar a próxima manchete pode reutilizar as mesmas colunas com a ajuda de como interpretar estudos pré-clínicos: pergunte qual é a espécie e o antigénio, qual o papel do composto, quais os endpoints e se o resultado corresponde ao curso da doença ou a um retrato instantâneo do tecido.

O resultado do tratamento: o que mudou com a administração

O estudo de tratamento de 2016 no Journal of Neuroimmunology utilizou ratinhos C57BL/6 fêmeas, com cerca de 8 a 10 semanas de idade, imunizados com 250 micrograms de MOG35-55 por ratinho. Após a indução, os animais com EAE foram distribuídos aleatoriamente por um grupo de azul de metileno ou por um grupo de EAE não tratado, e as pontuações clínicas foram acompanhadas até aproximadamente ao dia 30.

As pontuações clínicas foram significativamente mais baixas nos ratinhos tratados do que nos controlos com EAE entre o dia 15 e o dia 30, com P inferior a 0.01. A análise da medula espinal apontou na mesma direção, com menor infiltração inflamatória, menor desmielinização e menor perda axonal nos animais tratados.

A parte distintiva foi o painel de sinalização. O tratamento aumentou a ativação de AMPK e a expressão de SIRT1 e suprimiu a ativação de NF-kB, um regulador central da inflamação. No lado da imunidade adaptativa, reduziu a resposta Th17 e reforçou a resposta Treg. A cadeia proposta é, portanto, azul de metileno para AMPK e SIRT1, para menor sinalização de NF-kB, para uma mudança de Th17 inflamatórias para Treg reguladoras, para lesão tecidular mais ligeira, para pontuações mais baixas.

Essa cadeia é uma interpretação, não uma sequência causal comprovada. O estudo mostra o fármaco, as alterações de sinalização e a melhoria da doença a ocorrerem em conjunto. Não prova que AMPK e SIRT1 sejam responsáveis por todo o benefício, e o texto indexado publicamente não apresenta com clareza suficiente a dose exata em milligram per kilogram, a via, o dia de início ou a duração para que seja possível reproduzir o regime apenas a partir do resumo. Considere não verificado qualquer valor de dose citado sobre este artigo numa página de vendas, a menos que faça referência aos métodos do texto integral. A base mais ampla de evidência em humanos sobre o azul de metileno é o local onde deve verificar se este sinal imunitário inicial alguma vez evoluiu para dados clínicos.

O resultado de patologia: o que mostraram seis meses de tecido

O estudo de 2015 com MP4 na PLoS ONE utilizou ratinhos C57BL/6 fêmeas imunizados com 200 micrograms de MP4 em adjuvante completo de Freund, mais toxina da tosse convulsa no dia da imunização e novamente 48 hours depois. Nenhum animal recebeu azul de metileno como fármaco. Após fixação e inclusão, cortes transversais da medula espinal com 1 micrometer foram corados com azul de metileno para microscopia ótica, recorrendo-se também a microscopia eletrónica do trato ventrolateral para obter maior detalhe.

O tecido foi amostrado em três fases: pico agudo com 7 ratinhos, três meses após o início com 5 ratinhos e seis meses após o início com 10 ratinhos. As pontuações clínicas médias nessas fases pareciam quase idênticas, próximas de 1.7 a 1.8 na escala de 0 a 5. O tecido contou uma história diferente. A lesão isolada da mielina aumentou de cerca de 569,000 fibras por milímetro quadrado no pico agudo para cerca de 1,496,000 aos seis meses, sendo a comparação entre a fase aguda e o longo prazo significativa com P igual a 0.027. A lesão combinada da mielina e dos axónios aproximadamente duplicou aos seis meses. As fibras em remielinização mantiveram-se abaixo de um por cento em todas as fases, um dado pouco encorajador quanto às perspetivas de reparação.

A lesão axonal seguiu um padrão em U: elevada no pico agudo, mais baixa aos três meses e mais elevada aos seis meses, e correlacionou-se com edema mitocondrial e com uma redução do espaçamento entre neurofilamentos. A avaliação foi realizada sem conhecimento da pontuação nem da fase, o que reforça a interpretação de que as pontuações clínicas subestimaram a continuação dos danos estruturais.

Essa discrepância é o verdadeiro contributo do estudo para um leitor interessado em EM. Uma pontuação de incapacidade estável não significava tecido estável. Também demonstra por que motivo este artigo não pode sustentar qualquer alegação de tratamento com azul de metileno para EM. Testou o efeito do tempo, não um tratamento.

Por que nenhum dos estudos demonstra benefício em doentes

Considere cada artigo como uma resposta adequada a uma pergunta restrita e como não respondendo de todo à questão relativa aos doentes.

Em primeiro lugar, a causa é diferente. A EAE é provocada intencionalmente com um antigénio definido e um adjuvante. A EM humana desenvolve-se espontaneamente, com um repertório imunitário mais amplo que inclui células T, células B, imunidade inata e glia residente. Um composto que altera uma resposta enviesada para MOG num ratinho não tem necessariamente de alterar essa resposta humana mais ampla.

Em segundo lugar, o fenótipo é diferente. A fraqueza ascendente da cauda para os membros posteriores num ratinho é uma medida prática. Comprime a heterogeneidade da EM humana num único valor motor. Os fármacos alteram frequentemente as pontuações de EAE a curto prazo sem alterarem a evolução da doença em humanos, razão pela qual a EAE é uma ferramenta de rastreio e estudo de mecanismos, e não uma clínica em miniatura.

Em terceiro lugar, a exposição e o momento da administração permanecem por esclarecer. A administração contínua e precoce numa experiência de 30 day em ratinhos não equivale ao uso oral crónico numa pessoa com doença estabelecida, e nenhum dos estudos mediu os níveis do fármaco no sistema nervoso. Sem essa ligação, não existe uma ponte entre uma concentração numa placa ou uma dose num ratinho e um regime para humanos.

Em quarto lugar, os dois artigos não se replicam mutuamente. Antigénios diferentes, perguntas diferentes, endpoints diferentes e, num dos casos, nenhum tratamento. Citá-los em conjunto como dois estudos positivos de tratamento da EM constitui um erro de categoria.

O que isto significa para os leitores que avaliam as evidências

Nestes artigos não existe qualquer protocolo estabelecido de azul de metileno para EM. O estudo de tratamento sustenta investigação adicional sobre AMPK, SIRT1, NF-kB e o equilíbrio entre Th17 e Treg em EAE com MOG. O estudo de patologia recorda que a lesão tecidular pode progredir enquanto as pontuações permanecem estáveis, e que azul de metileno numa secção de métodos pode por vezes significar um frasco de corante, e não um medicamento. Os leitores que acompanham a investigação em curso sobre esclerose múltipla devem manter presente essa distinção entre corante e fármaco. Questões de segurança, incluindo riscos sanguíneos e de interação, devem ser discutidas com um profissional de saúde juntamente com os dados gerais de segurança do azul de metileno antes de alguém agir com base em manchetes sobre investigação laboratorial.

A conclusão cabe numa frase. Um dos estudos citados administrou azul de metileno a ratinhos com EAE induzida por MOG e relatou doença mais ligeira acompanhada por uma alteração imunitária anti-inflamatória, enquanto o outro estudo citado não administrou qualquer tratamento e utilizou azul de metileno apenas para corar a medula espinal enquanto documentava seis meses de acumulação de danos na mielina e nos axónios, pelo que o conjunto dos dois estudos não demonstra que o azul de metileno beneficie pessoas com EM. :::