Azul de metileno e ferroptose: mecanismo de peroxidação lipídica

A ferroptose é morte celular causada por danos nas membranas. As gorduras polinsaturadas presentes nas membranas oxidam-se numa reação em cadeia, a membrana deixa de funcionar e a célula morre. O ferro é necessário para esta química. Essa frase resume todo o conceito, e tudo neste artigo testa uma parte dele.

A questão aqui é mais específica: o que faz o azul de metileno a essa cadeia em experiências celulares e o que demonstra realmente esse resultado. A resposta curta é que, em dois estudos laboratoriais, o azul de metileno em concentrações nanomolares reduziu a peroxidação lipídica mitocondrial e manteve as células vivas após estímulos que, de outro modo, provocariam ferroptose. A resposta mais longa é mais importante, porque cada elo da cadeia foi testado com uma intervenção diferente, e cada intervenção tem limitações.

Ferroptose num parágrafo

Um fosfolípido de membrana que contém uma cauda de ácido gordo polinsaturado tem um ponto fraco: átomos de hidrogénio que são fáceis de remover. Quando um radical remove um deles, o oxigénio adiciona-se ao lípido, forma-se um radical peroxilo lipídico e esse radical retira hidrogénio ao lípido seguinte. A reação propaga-se ao longo da membrana, a menos que algo a interrompa.

O principal mecanismo de interrupção é uma enzima chamada GPX4, que utiliza glutationa para reduzir peróxidos lipídicos a álcoois lipídicos inofensivos. Os estímulos laboratoriais atacam esta defesa em pontos definidos. A erastina bloqueia a importação de cistina através do sistema xc-minus, privando a célula de cisteína necessária à síntese de glutationa. A butionina sulfoximina bloqueia diretamente a síntese de glutationa. O RSL3 inibe a própria GPX4. Os três deixam os peróxidos por eliminar, mas fazem-no em etapas diferentes, pelo que um resultado obtido com um estímulo não se generaliza automaticamente aos restantes.

A ferroptose distingue-se da apoptose pelas propriedades que a definem. Não existe uma cascata de caspases nem corpos apoptóticos. Quelantes de ferro como a deferoxamina e agentes sequestradores de radicais como a ferrostatina-1 suprimem-na, sendo este o teste operacional utilizado pelos investigadores para classificar uma morte como ferroptótica, em vez de meramente necrótica. O panorama mais amplo das vias reguladas de morte celular contextualiza esta distinção, e a forma como as células gerem o ferro lábil explica por que motivo a quelação constitui um controlo tão decisivo.

Onde entram as mitocôndrias e por que motivo isso foi objeto de debate

Trabalhos iniciais indicaram que células sem ADN mitocondrial continuam a sofrer ferroptose, o que sugeria que as mitocôndrias seriam opcionais. Trabalhos posteriores mostraram que a depleção das mitocôndrias, ou o bloqueio da respiração, pode suprimir a ferroptose causada pela privação de cisteína, mas não a causada pela inibição direta da GPX4. Ambos os resultados podem ser verdadeiros se a contribuição mitocondrial depender do estímulo, do tipo celular e do local onde ocorre a peroxidação determinante.

O estudo que serve de base a este artigo abordou a questão com uma sonda específica para um compartimento celular. A MitoCLox é uma versão direcionada para as mitocôndrias de um marcador de peroxidação lipídica: altera a fluorescência quando encontra radicais peroxilo lipídicos no interior das mitocôndrias. Em fibroblastos tratados com erastina, a oxidação da sonda mitocondrial surgiu em células ainda vivas antes da morte e apresentou heterogeneidade na população. Esta sequência temporal é importante. A peroxidação que antecede a morte é uma causa candidata. A peroxidação medida apenas em células mortas é detrito. Um guia complementar sobre ensaios de peroxidação lipídica e o que cada sonda mede explica por que motivo a localização da sonda determina o significado de um sinal.

O mesmo padrão surgiu num segundo modelo. Fibroblastos de um doente com neuropatia óptica hereditária de Leber, que apresentam uma mutação no complexo I e maior stress oxidativo basal, morreram por ferroptose quando a glutationa foi esgotada, enquanto os fibroblastos de controlo resistiram. Mais uma vez, a oxidação da sonda mitocondrial surgiu primeiro. Os detalhes encontram-se no estudo de fibroblastos sobre a peroxidação lipídica mitocondrial na ferroptose.

O que o azul de metileno alterou nestas experiências

O azul de metileno é um transportador redox. A sua forma oxidada aceita eletrões provenientes da química ligada ao NADH no complexo I, e a sua forma reduzida doa-os ao citocromo c, que alimenta o complexo IV. Isto cria um desvio parcial em torno do segmento da cadeia onde os eletrões normalmente escapam para o oxigénio sob a forma de superóxido. Os leitores que pretendam compreender todo o circuito de transferência devem começar por como o azul de metileno transporta eletrões através das mitocôndrias.

Em fibroblastos pulmonares tratados com erastina, o azul de metileno a 250 nanomolar preservou a viabilidade num ensaio de sobrevivência celular, juntamente com os antioxidantes direcionados para as mitocôndrias SkQ1 e MitoTEMPO. Os controlos definem o alcance da conclusão. A ferrostatina-1, o alfa-tocoferol e a deferoxamina também conferiram proteção, confirmando que a morte era ferroptótica. O análogo de SkQ1 sem grupo antioxidante não conferiu proteção, o que aponta para a química redox, em vez de uma acumulação inespecífica. A proteção diminuiu acima de aproximadamente 200 nanomolar SkQ1, em consonância com o conhecido comportamento pró-oxidante dos antioxidantes de quinona em cargas mais elevadas. O azul de metileno apresenta o mesmo comportamento bifásico dependente da dose: é protetor a baixas concentrações nanomolares nestas culturas e pode gerar peróxido de hidrogénio por ciclagem redox quando a concentração aumenta ou quando é exposto a iluminação intensa. Este tipo de contexto de dose é abordado em espécies reativas de oxigénio nas mitocôndrias.

As experiências com mitocôndrias isoladas separaram depois as fontes de ROS. Na presença de ferro ferroso, substratos que alimentavam o complexo I em conjunto com rotenona estimularam a oxidação da sonda. A rotenona bloqueia a cadeia a jusante do local da flavina, pelo que os transportadores a montante permanecem reduzidos e deixam escapar eletrões para o oxigénio a partir da flavina orientada para a matriz. Substratos que alimentavam o complexo III em conjunto com antimicina A produziram peróxido de hidrogénio em abundância, mas não induziram peroxidação lipídica. O mesmo sinal global de ROS, uma localização diferente e um resultado diferente. Tanto o SkQ1 como o azul de metileno suprimiram a peroxidação impulsionada pelo complexo I sem suprimir a própria produção de peróxido de hidrogénio, o que situa a sua ação após a formação de ROS, na etapa da peroxidação lipídica.

O ramo da sobrecarga de ferro e a pista da lipofuscina

Um segundo estudo abordou a questão pelo lado do ferro. Cardiomiócitos H9c2 expostos a concentrações submillimolar de citrato férrico de amónio desenvolveram ROS mitocondriais, peroxidação lipídica mitocondrial e, depois, ferroptose, seguida da acumulação de um pigmento semelhante à lipofuscina no espaço de 24 hours. A lipofuscina é o resíduo autofluorescente contendo ferro de lípidos e proteínas oxidados que se acumula com a idade, e o seu rápido aparecimento neste caso relaciona a peroxidação aguda induzida pelo ferro com um marcador clássico do envelhecimento. O azul de metileno e o SkQ1, ambos em concentrações nanomolares, impediram a peroxidação, a morte e a acumulação do pigmento. Mitocôndrias cardíacas isoladas confirmaram o padrão: rotenona mais ferro ferroso induziram peroxidação e um sinal semelhante ao do pigmento, e ambos os agentes bloquearam esse processo. A sequência completa é descrita no estudo de sobrecarga de ferro em cardiomiócitos H9c2. A componente do pigmento nesta história enquadra-se em lipofuscina e marcadores de envelhecimento celular.

O que os ensaios de sobrevivência celular não demonstram

Uma medição de viabilidade como a CellTiterBlue indica quantas células numa cultura permanecem metabolicamente ativas após um estímulo combinado com um potencial agente protetor. Trata-se de um teste de um mecanismo num sistema definido. Não é um resultado terapêutico. Nenhuma destas experiências administrou uma dose a um doente, mediu um desfecho de doença ou estabeleceu uma janela terapêutica num organismo.

Quatro limitações merecem ser explicitadas. Primeiro, os tipos celulares são restritos: fibroblastos pulmonares transformados, fibroblastos cutâneos primários, incluindo uma linha com doença mitocondrial, e uma linha de cardiomiócitos de rato, além de mitocôndrias isoladas de coração de rato. A sensibilidade variou entre linhas, e a linha LHON era particularmente vulnerável por conceção experimental. Segundo, os estímulos são extremos laboratoriais: bloqueio total do transporte ou da síntese e cargas de ferro que nenhum tecido encontraria de forma aguda. Terceiro, a concentração não se converte por simples multiplicação. Uma concentração nanomolar num meio de cultura não corresponde a uma dose humana, e a distribuição do azul de metileno, a sua redução à forma incolor no sangue e nos tecidos, a exposição à luz e o potencial de membrana são fatores que separam uma cultura de uma pessoa. Quarto, as sondas medem o seu próprio compartimento. A oxidação da MitoCLox mostra que se formaram radicais lipídicos mitocondriais; não demonstra que a rutura da membrana plasmática, provavelmente o evento terminal, tenha sido diretamente impedida, em vez de evitada a montante.

Assim, a conclusão sustentada pelos dados é esta: nestes modelos, as ROS derivadas do complexo I em conjunto com o ferro promovem peroxidação lipídica mitocondrial que antecede a ferroptose, e o azul de metileno em baixas concentrações interrompe esse segmento. Qualquer conclusão para além desse segmento exige experiências diferentes em animais e, posteriormente, em seres humanos.