Alternativas ao Azul de Metileno para Microscopia

Para um esfregaço bacteriano simples, a violeta de cristal pode substituir o azul de metileno quando o objetivo é observar a forma das células. Para células vivas, uma alternativa melhor pode ser o contraste de fase sem qualquer coloração. A escolha depende da observação que precisa de fazer.

Suponha que duas pessoas estejam a examinar a mesma cultura bacteriana. Uma quer distinguir bacilos de células redondas. A outra quer saber se um tratamento matou as bactérias. Uma coloração que proporciona à primeira pessoa uma imagem nítida pode não dar à segunda qualquer resposta útil.

Antes de escolher um substituto, complete esta frase: “Preciso de observar ___ em ___, e as células têm / não têm de permanecer vivas.” Esta frase define a função que a coloração tem de cumprir.

Comece pela amostra e pela pergunta

Primeiro, decida se as células têm de permanecer vivas e, em seguida, identifique a característica que precisa de observar:

As células têm de permanecer vivas: para movimento ou forma, considere contraste de fase sem coloração ou DIC; para DNA nuclear, considere Hoechst 33342 com fluorescência; para integridade da membrana, escolha um ensaio validado, como SYTO 9 com iodeto de propídio.
As células não têm de permanecer vivas: para morfologia bacteriana, considere uma coloração simples com violeta de cristal ou uma coloração negativa com nigrosina; para reação de Gram, utilize o método completo de coloração de Gram; para DNA nuclear em células fixadas, considere fluorescência com DAPI. Utilize esta tabela para comparar as limitações de cada opção. Estas são escolhas de método, não instruções para trocar frascos dentro de um protocolo existente.

O que precisa de observar	Amostra e equipamento	Alternativa possível	Principal limitação
Forma e disposição das bactérias	Esfregaço bacteriano preparado; campo claro	Coloração simples com violeta de cristal	Mostra a morfologia; não determina a reação de Gram nem a viabilidade.
Contornos celulares sobre um fundo escuro	Preparação bacteriológica; campo claro	Coloração negativa com nigrosina	A preparação e a formulação são importantes; uma célula não corada não está necessariamente viva.
Reação de Gram	Esfregaço bacteriano preparado; campo claro	Método completo de coloração de Gram	Requer a sequência completa de reagentes e controlos.
Movimento ou alterações em células vivas	Preparação a fresco compatível; contraste de fase ou DIC	Sem coloração	Requer ótica adequada; o contraste não identifica uma molécula.
DNA nuclear	Células fixadas; fluorescência	DAPI	Requer filtros de excitação e emissão compatíveis.
DNA nuclear em células vivas	Células vivas; fluorescência	Hoechst 33342	A entrada nas células não demonstra que as condições de aquisição de imagem sejam inócuas.
Integridade da membrana bacteriana	Bactérias não fixadas; fluorescência	SYTO 9 com iodeto de propídio	A coloração da membrana é uma medida indireta da viabilidade.

Para um esfregaço simples, substitua o método com cuidado

A violeta de cristal é uma opção prática quando a tarefa consiste em obter uma imagem de uma só cor da morfologia bacteriana. O Bacteriological Analytical Manual da FDA apresenta duas formulações de violeta de cristal adequadas para coloração simples. Utilize uma formulação documentada e o respetivo método de preparação; o nome do corante, por si só, não especifica um reagente pronto a utilizar.

A violeta de cristal também é utilizada na coloração de Gram, mas isso não transforma uma coloração simples com violeta de cristal numa coloração de Gram. No protocolo de coloração de Gram da ASM, o resultado diferencial depende da atuação sequencial da violeta de cristal, do iodo, da descoloração e da contracoloração. Omitir esses passos altera aquilo que a imagem permite determinar. Consulte coloração simples versus coloração de Gram para compreender esta distinção.

A nigrosina oferece outra forma de revelar os contornos: escurece o fundo, enquanto as células bacterianas permanecem comparativamente claras. Há um pormenor útil nas instruções da Merck para a nigrosina que uma lista genérica de substitutos pode não mencionar. A formulação de trabalho especificada contém formaldeído. Por isso, não se pode inferir a compatibilidade com células vivas apenas a partir da expressão “coloração negativa”, mesmo que as próprias células pareçam não estar coradas. Verifique a formulação completa e a preparação da amostra.

Para amostras vivas, considere alterar a ótica

Se pretende observar células a moverem-se ou a dividirem-se, a introdução de outro corante pode complicar a observação. Como a Nikon explica no seu guia sobre contraste em amostras transparentes, o contraste de fase e o contraste de interferência diferencial, ou DIC, tornam as amostras visíveis através das diferenças nas suas propriedades óticas. Podem revelar células vivas e não coradas, desde que o microscópio disponha dos componentes necessários.

Esta opção mantém uma preparação sem coloração, mas altera a informação disponível. Pode acompanhar um limite celular ou um movimento sem saber qual molécula produziu o contraste. Se a questão for a localização molecular, selecione antes um método de marcação adequado.

Para DNA nuclear, a comparação da Invitrogen entre as colorações DAPI e Hoechst distingue a utilização habitual de DAPI com células fixadas do Hoechst 33342, mais permeável às células e preferido para a marcação de células vivas. Ambos requerem equipamento de fluorescência. Nenhum deles é um substituto direto de uma coloração colorida para campo claro.

Trate a exposição ao corante e a iluminação como condições experimentais. Compare preparações coradas e não coradas quando o comportamento das células for a sua medida.

Uma célula vermelha não é automaticamente uma célula morta

SYTO 9 e iodeto de propídio são frequentemente utilizados em conjunto para avaliar a integridade da membrana bacteriana. O manual BacLight associa membranas intactas à coloração verde e membranas danificadas à coloração vermelha. Essa interpretação precisa de ser validada para a amostra em questão.

Um estudo de 2019 de Rosenberg e colaboradores ilustra o problema. Em biofilmes de E. coli com 24 horas sobre vidro em solução salina tamponada com fosfato, cerca de 96% das células pareceram positivas para iodeto de propídio in situ. No entanto, os autores estimaram que 82% eram cultiváveis após a recolha. As imagens confocais mostraram células com interiores verdes por baixo de material corado de vermelho, apontando para ácidos nucleicos extracelulares como responsáveis pelo sinal enganador.

Estas percentagens descrevem medições diferentes realizadas nas preparações do estudo, não um fator de correção universal. A conclusão útil é verificar o que gerou o sinal. Num biofilme, um corante de ácidos nucleicos pode detetar material fora das células, além do que existe no interior de células danificadas. Para chegar a uma conclusão sobre viabilidade, os investigadores recomendam medições complementares, como cultivo ou atividade metabólica, reconhecendo simultaneamente que cada método tem limitações.

Verifique o que a alternativa realmente contém

Um método de coloração alternativo pode ainda conter azul de metileno. Giemsa é um exemplo: a Merck descreve o seu produto como uma solução de azure-eosina-azul de metileno, destinada a aplicações que incluem esfregaços de sangue e de medula óssea. Pode ser um método diferente para uma amostra diferente, mas não satisfaz um requisito de exclusão do azul de metileno.

Se a exclusão de um composto fizer parte da experiência, verifique a identidade e a formulação do reagente antes de comparar imagens. O guia sobre azul de metilo, azul de metileno e corantes com nomes semelhantes aborda as diferenças de nomenclatura.

Verifique a substituição antes de utilizar o resultado

Para um novo método, faça uma pequena comparação utilizando amostras representativas e um controlo adequado. Mantenha as definições do microscópio comparáveis sempre que possível. Registe a formulação do reagente, a preparação da amostra, a exposição e as condições de aquisição de imagem para que uma imagem com melhor aspeto possa ser investigada, em vez de ser simplesmente preferida.

Avalie o sucesso em função da pergunta original. Para morfologia, verifique se os limites e a disposição das células continuam interpretáveis. Para marcação nuclear, avalie a localização do sinal e o fundo. Para viabilidade, exija evidência para além de uma separação de cores visualmente apelativa. O guia mais abrangente sobre coloração com azul de metileno e aplicações laboratoriais explica como a observação e a preparação se relacionam.

Escolha a alternativa que preserve a medição de que necessita. A cor é apenas uma das propriedades da imagem resultante.