Identyfikacja błękitu metylenowego w laboratorium: widma w podczerwieni i metody uzupełniające

Wyobraź sobie, że trzy laboratoria otrzymują ten sam niebieski proszek. Pierwsze rejestruje widmo w podczerwieni i stwierdza, że to błękit metylenowy. Drugie przeprowadza analizę chromatograficzną i podaje zawartość Azure B wynoszącą 0.4%. Trzecie bada dyfrakcję promieni rentgenowskich na kryształach i określa postać hydratu. Wszystkie trzy mają rację, ale żadne nie odpowiedziało na pozostałe dwa pytania. Nieporozumienia zaczynają się wtedy, gdy jeden wynik traktuje się jako odpowiedź na wszystkie trzy.

Ten artykuł rozdziela te pytania. Identyfikacja w podczerwieni potwierdza tożsamość cząsteczkową przez porównanie ze wzorcem odniesienia. Chromatografia określa skład. Dyfrakcja określa postać w stanie stałym. Pozytywny wynik badania tożsamości nie jest certyfikatem czystości.

Identyfikacja w podczerwieni dobrze odpowiada na jedno pytanie

Farmakopealne badanie tożsamości błękitu metylenowego polega na porównaniu widma ze wzorcem, a nie na sprawdzeniu listy pików. W podglądzie monografii USP dotyczącej błękitu metylenowego badanie tożsamości A odwołuje się do spektroskopii w podczerwieni z użyciem układu optycznego ATR albo pastylki z bromku potasu. Widmo próbki musi odpowiadać widmu wzorca odniesienia USP, przy czym próbkę i wzorzec należy przygotować i zarejestrować w równoważnych warunkach. O wyniku nie decyduje żadna ustalona lista diagnostycznych liczb falowych. Decyduje zgodność nałożonych widm.

Takie podejście odzwierciedla zachowanie widm FTIR błękitu metylenowego. Najsilniejsze pasma znajdują się w obszarze odcisku palca. Przypisania opisane w literaturze konsekwentnie umieszczają główne pasmo sprzężonego układu pierścieniowego w pobliżu 1590 do 1600 cm-1, gdzie sprzęgają się drgania rozciągające aromatycznych wiązań węgiel–węgiel i węgiel–azot. Kolejne pasma w pobliżu 1490 i 1390 cm-1 mają charakter drgań pierścienia oraz drgań deformacyjnych wiązań węgiel–azot i węgiel–wodór. Pasma w pobliżu 1355 i 1330 cm-1 obejmują wiązania węgiel–azot grup dimetyloaminowych i drgania deformacyjne grup metylowych. Pasma w pobliżu 1225 do 1250 cm-1 należą do szkieletu heterocyklicznego, natomiast pasma w pobliżu 1170 do 1130 i 1066 cm-1 mają charakter drgań wiązań węgiel–siarka; drgania zginające aromatycznych wiązań C-H występują w pobliżu 880 cm-1. Drgania rozciągające pojawiają się przy wyższych liczbach falowych: aromatyczne C-H w pobliżu 3040 cm-1, a C-H grup N-metylowych między około 2900 a 3000 cm-1. Opublikowane przypisania różnią się szczegółami, ponieważ szkielet fenotiazyniowy drga jako układ sprzężony. Każdą pojedynczą tabelę przypisań należy więc traktować jako jedno z opisanych ujęć, a nie jedyną możliwą interpretację.

Na uwagę zasługują dwa efekty związane z przygotowaniem próbki, ponieważ zmieniają widma IR błękitu metylenowego bez zmiany samego barwnika. Po pierwsze, materiał uwodniony wykazuje szerokie pasmo O-H w obszarze około 3300 do 3500 cm-1 oraz drgania zginające wody w pobliżu 1630 do 1640 cm-1, a różne postacie hydratów powodują mierzalne przesunięcia pasm w obszarze odcisku palca. Po drugie, matryca pastylki KBr jest higroskopijna: pochłonięta wilgoć daje pasma dokładnie w tych obszarach charakterystycznych dla wody i może zostać błędnie uznana za wodę hydratacyjną próbki. Pomiar ATR pozwala uniknąć matrycy KBr, ale intensywności pasm ATR zależą od głębokości wnikania, która zmienia się wraz z liczbą falową. Dlatego widma ATR i widma transmisyjnego tego samego proszku nie można bezpośrednio na siebie nakładać. Praktyczna zasada wynika z wymogu farmakopealnego: porównuj próbkę i wzorzec zarejestrowane tą samą techniką oraz dokumentuj, której techniki użyto. Podstawy chemii kationu, soli i hydratów odpowiadających za te widma opisano w opracowaniu dotyczącym struktury i właściwości błękitu metylenowego.

Tabela wyboru metody analitycznej

Ta tabela pomaga wybrać metodę. Czytając dany wiersz, sprawdzisz, na jakie pytanie odpowiada metoda, co potwierdza pozytywny wynik i czego nadal nie dowodzi.

Dlaczego zgodność widma w podczerwieni nie jest certyfikatem czystości

Zgodność w badaniu tożsamości pozwala wykluczyć niewłaściwy barwnik. Nie stanowi jednak pełnego wykazu składników próbki. Najważniejsze są trzy ograniczenia.

Po pierwsze, blisko spokrewnione związki mają podobne widma w podczerwieni. Azure B różni się od błękitu metylenowego jedną grupą metylową, dlatego jego widmo bardzo przypomina widmo błękitu metylenowego. Widmo mieszaniny zawierającej kilka procent Azure B nadal dobrze pokrywa się z widmem wzorca błękitu metylenowego. Wykrywanie tego zanieczyszczenia jest zadaniem chromatografii, opisanym w przewodniku po zanieczyszczeniach błękitu metylenowego i metodach ich badania.

Po drugie, spektroskopia w podczerwieni bada próbkę jako całość i ma ograniczoną czułość wobec składników obecnych w niewielkich ilościach. Małe ilości pokrewnych barwników, pozostałości rozpuszczalników lub pozostałości nieorganicznych są maskowane przez główne pasma. Brak dodatkowych pików jest słabym dowodem na brak zanieczyszczeń.

Po trzecie, wzorzec odniesienia determinuje całe porównanie. Wzorzec zdegradowany, o widmie przesuniętym wskutek uwodnienia lub nieprawidłowo traktowany zmienia punkt odniesienia. Tak samo działa zestawienie różnych technik, na przykład ocena widma próbki uzyskanego metodą ATR względem wzorca w KBr. Przy każdym wyniku zapisuj numer partii wzorca, technikę i sposób przygotowania.

Mieszaniny wymagają jeszcze jednej uwagi. Widmo, które w większości odpowiada wzorcowi, ale ma ramiona pasm lub anomalie intensywności, nie oznacza pozytywnego wyniku z zastrzeżeniami. To sygnał, że przed identyfikacją należy rozdzielić składniki próbki.

Metody uzupełniające w praktyce

HPLC błękitu metylenowego dostarcza informacji o składzie, których nie może dać spektroskopia w podczerwieni. Obecna metoda farmakopealna wykorzystuje kolumnę typu fenylowego z gradientem woda–acetonitryl zawierającym kwas trifluorooctowy oraz detekcję przy 246 nm, a nie w zakresie widzialnym. Tożsamość ustala się na podstawie zgodności czasu retencji ze wzorcem odniesienia; to samo porównanie służy do oznaczenia zawartości. W badaniu zanieczyszczeń organicznych Azure B identyfikuje się za pomocą osobnego materiału odniesienia, przy retencji względnej około 0.8 względem błękitu metylenowego o retencji 1.0, i wymaga się wysokiej rozdzielczości między tymi dwoma pikami. Zwróć uwagę na wybór długości fali: w szeregu związków powstających wskutek demetylacji absorpcja przesuwa się stopniowo ku czerwieni, od tioniny w pobliżu 600 nm, przez Azure C, Azure A i Azure B, aż do błękitu metylenowego w pobliżu 670 nm. Detektor ustawiony na stałą długość fali w pobliżu 660 nm reaguje więc nierównomiernie na związki w tym szeregu i zaniża wyniki dla niektórych homologów. Pełne profilowanie całego szeregu, gdy jest potrzebne, należy przeprowadzać metodą LC-MS/MS z kolumną C18 i kwalifikowanymi wzorcami każdego analitu.

Dyfrakcja proszkowa odpowiada na pytanie o stan stały, którego dwie powyższe metody nie rozstrzygają, ponieważ niszczą potrzebną informację lub jej nie uwzględniają: rozpuszczenie proszku do chromatografii usuwa informację o kryształach, a drgania cząsteczkowe opisują wiązania, nie zaś uporządkowanie dalekiego zasięgu. Dyfraktogramy pozwalają rozróżnić fazy hydratów i ocenić krystaliczność, a błękit metylenowy wymaga takiej analizy bardziej niż większość materiałów. Badania stanu stałego przeprowadzone przez Ragera i współpracowników pozwoliły zidentyfikować pięć odrębnych struktur hydratów, w tym pentahydrat, dwa dihydraty, monohydrat i hydrat pośredni; wśród scharakteryzowanych postaci nie stwierdzono rzeczywistego trihydratu. Znaczenie ma tutaj sposób postępowania w laboratorium: wilgotność i temperatura zmieniają stabilność hydratów, a intensywne rozdrabnianie może zmienić fazę lub obniżyć krystaliczność. Należy więc kontrolować i dokumentować wilgotność względną oraz temperaturę, a mielenie ograniczać do minimum. Oznaczanie postaci hydratu na etykiecie i jej wpływ na odważaną masę omówiono szerzej w artykule o postaciach hydratów błękitu metylenowego i ich oznaczaniu na etykietach.

Absorpcja UV-Vis pełni rolę pomocniczą. Znane maksima potwierdzają oczekiwane zachowanie roztworu i umożliwiają oznaczanie stężenia. Niebieski roztwór absorbujący przy oczekiwanej długości fali jest jednak jedynie zgodny z charakterystyką błękitu metylenowego, a nie dowodem jego tożsamości, ponieważ pokrewne barwniki absorbują w pobliskim zakresie.

O co zapytać przed zakupem

Przełóż te rozróżnienia na pytania przy zakupie. Zapytaj, którą partię zbadano, jaką techniką potwierdzono tożsamość, czy w badaniu zanieczyszczeń metodą HPLC użyto materiału odniesienia Azure B oraz czy postać hydratu scharakteryzowano, czy tylko założono. Przede wszystkim zapytaj, czy certyfikat obejmuje pełną specyfikację, czy tylko wybrane badania. Wielu sprzedawców deklarujących zgodność z farmakopeą bada wyłącznie metale ciężkie, pozostawiając bez odpowiedzi pytania o tożsamość, zawartość, zanieczyszczenia organiczne, rozpuszczalniki i jakość mikrobiologiczną.

Blupreme prowadzi badania według pełnej specyfikacji USP, obejmujące tożsamość, czystość, zanieczyszczenia organiczne, pozostałości rozpuszczalników, zanieczyszczenia pierwiastkowe, pozostałość po prażeniu, limity mikrobiologiczne i endotoksyny bakteryjne, we współpracy z farmaceutycznym producentem błękitu metylenowego. Publiczny certyfikat analizy każdej partii jest publikowany na stronie badań jakości Blupreme, dzięki czemu podstawę oznaczenia zawartości i wyniki badań zanieczyszczeń można odczytać bezpośrednio, zamiast je wywnioskowywać. Nawet wyniki bliskie 100% wymagają podania podstawy obliczeń, co wyjaśnia przewodnik po wynikach oznaczenia zawartości przekraczających 100 procent. Potwierdzenie tożsamości rozpoczyna analizę. Pełna dokumentacja ją zamyka.