Historien om metylenblått: fra fargestoff til legemiddel og forskning

Metylenblått nådde en pasient før det nådde et apotek.

Rapporten fra 1891 av Paul Guttmann og Paul Ehrlich om bruken av fargestoffet ved malaria inneholder to temperaturkurver. Den andre går fra 13 July til 5 August, med behandlingen skrevet langs margen dag for dag. Oppføringene 18 og 19 July lyder "1 × 0,05 Methylenblau". De følgende dagene er fem og syv doser av samme mengde oppført, og innen 22 July har en liten mengde kinin kommet med i journalen. Feberkurven, som svinger mellom 37 °C og 39.5 °C gjennom første halvdel av diagrammet, flater ut etter at fargestoffet introduseres og holder seg mellom omtrent 36 °C og 37.5 °C i de resterende tre ukene.

Pasienten var én av to, beskrevet i artikkelen som en hustjener og en sjømann. Stoffet de fikk, hadde vært et kommersielt tekstilfargestoff i femten år, og de to mennene er blant de første menneskene som er dokumentert behandlet med et helsyntetisk legemiddel rettet mot en bestemt organisme.

Fargestoffet kom først

Det første kommersielt vellykkede syntetiske fargestoffet ble laget av William Henry Perkin i 1856. Perkin var atten år, arbeidet i et hjemmelaboratorium i påskeferien og forsøkte å syntetisere kinin. I stedet fikk han en svart rest, løste den opp og fant en farge som festet seg strålende til silke. Han patenterte den i August 1856 og hadde innen utgangen av 1857 en fabrikk som leverte til et silkefargeri i London.

I 1875 syntetiserte Adolf von Baeyer et rødt fargestoff og kalte det eosin, etter Eos, det greske ordet for daggry. I 1876 utviklet Heinrich Caro, som da var direktør for laboratoriet ved Badische Anilin- und Soda-Fabrik, metylenblått sammen med Baeyer som et anilinbasert fargestoff for bomull. Den kjemiske strukturen ble ikke endelig fastslått før omtrent ni år senere.

Denne opprinnelsen er fortsatt synlig i hvordan stoffet navngis. "Metylenblått" er et handelsnavn fra fargestoffkatalogen, ikke en kjemisk beskrivelse. Forbindelsen navnet viser til, er metyltioniniumklorid, og forskjellene mellom navnet, saltet og dets hydrater blir viktige så snart noen veier materialet eller leser en spesifikasjon.

Farging var broen

Veien fra fargeri til sykehus gikk gjennom mikroskopet, og den begynte før metylenblått eksisterte. Wilhelm Erb var den første som brukte et syntetisk fargestoff på blod, med pikrinsyre i 1865, og så et retikulært mønster inne i enkelte røde blodceller.

Paul Ehrlichs doktoravhandling fra 1878 sammenlignet histologisk farging med farging av tekstiler og argumenterte for at begge var kjemiske reaksjoner. Mens han arbeidet under Robert Koch med tuberkelbasillen, delte han anilinfargestoffer inn i sure og basiske klasser og slo fast at hver klasse farget forskjellige deler av en celle. I 1880 blandet han de to: en mettet løsning av metylenblått ble helt i sur fuksin til supernatanten klarnet. Resultatet, som han kalte neutralen Farbkörper, eller nøytralfarging, ga tre farger i stedet for én, avdekket granula i de polymorfonukleære cellene som ikke tidligere hadde vært synlige, og gjorde den første differensialtelling av leukocytter mulig. Fordi disse granulaene tok opp begge komponentene i blandingen, laget Ehrlich betegnelsen nøytrofil for cellene som bar dem.

To år senere brukte Koch metylenblått for å finne tuberkelbasillen, og i 1883 forbedret Ehrlich metoden. I 1886 publiserte han en observasjon av en annen type: Han injiserte fargestoffet i levende dyr og sammenlignet hvor sterkt hvert organ tok det opp, og konkluderte med at det hadde en markert affinitet for hjerne- og nervevev. Han tilskrev denne affiniteten fargestoffets oksidasjons-reduksjonssyklus, som han hadde observert året før. Denne syklusen er også grunnen til at en løsning av metylenblått mister fargen når oksygenet forbrukes, og får den tilbake når luft tilføres igjen. Eksperimentene som først målte konsekvensene av denne syklusen tilhører et senere tiår, og selve mekanismen er et eget tema, adskilt fra historien.

Parasitten og den lilla kjernen

Alphonse Laveran fant malariaparasitten i 1880 ved å undersøke ferskt, ufarget blod. For å se den rutinemessig i et tørket utstryk krevdes et fargestoff, og datidens fargemetoder ga bare rødt og blått.

I 1888 erstattet den polske patologen Czesław Cheçinski sur fuksin med eosin og laget en blanding av metylenblått og eosin. Tilfellet bak metoden hans var en soldat som døde av malaria 30 September 1887. I blodutstrykene så Cheçinski blå, tusenfrydlignende former, som nå identifiseres som Plasmodium malariae, og sigdformede former, som nå identifiseres som gametocytter av Plasmodium falciparum. Resultatet satte punktum for to konkurrerende forklaringer på sykdommen samtidig: miasmeteorien og påstanden fra Edwin Klebs og Corrado Tommasi-Crudeli om at malaria skyldtes en bakterie.

Parasitten var synlig. Kjernen var det ikke, noe som lot dens natur stå åpen. Ernst Malachowski, en lege i Breslau, løste problemet først ved en tilfeldighet og deretter med hensikt. Han la merke til differensialfarging av plasmodiekjernen i et preparat i 1889, men klarte ikke å gjenskape den. Det hjalp ikke å gjøre metylenblått surere. Å gjøre det alkalisk med boraks ga effekten hver gang. Han demonstrerte teknikken offentlig 15 June 1890 og publiserte den samme år, med en mer utførlig metode i August 1891.

Dmitri Romanowsky publiserte sin egen versjon i September 1891. De beste resultatene hans kom fra en forsømt, muggen flaske med metylenblåttløsning som var mer enn to måneder gammel. Malachowskis fremgangsmåte var tilsiktet og, med hans egne ord, lett å reprodusere; Romanowskys var et blindspor som virket én gang. Eponymet tilfalt likevel Romanowsky, og striden om hvem som frembrakte lillafargen som gjorde kjernen synlig er en egen historie med egne dokumenter.

Figur: den andre temperaturkurven fra Guttmann og Ehrlichs rapport fra 1891. Det øvre panelet dekker 13 til 24 July og det nedre panelet 25 July til 5 August; oppføringene i margen angir dosene som ble gitt, og temperaturen holder seg nær normalen de siste tre ukene av registreringen. Gjengitt fra rapporten slik den ble skannet for Krafts, Hempelmann og Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Modningen viste seg å være demetylering

Ingen av dem som var involvert på 1890-tallet, visste hva "modning" gjorde med metylenblått. Svaret kom fra industrikjemien. Heinrich August Bernthsen hadde syntetisert moderforbindelsen fenotiazin i 1883, fastslått i 1885 at metylenblått tilhørte denne familien, og i samme periode vist at alkaliske forhold fjerner metylgrupper fra fargestoffet og danner forbindelsene som nå kalles azurer.

Bernard Nocht ekstraherte den aktive fraksjonen i 1898 og 1899 og kunne bare kalle den Rot aus Methylenblau, rødt fra metylenblått. Michaelis identifiserte den som azure I i 1901. Jenner introduserte absolutt metanol som løsemiddel for fargeutfellingen i 1899, noe som fjernet behovet for varmefiksering av blodutstryk; Leishman og Reuter kombinerte begge fremskrittene; Wright publiserte en forenklet metode i 1902. Giemsas bidrag, også i 1902, var å slutte å basere seg på en tilfeldig modnet løsning og i stedet bruke målte mengder av kjente fargestoffer. Deretter nektet han å publisere hvordan han fremstilte rent metylenazur og solgte metoden til Dr. Grüblers laboratorium, som markedsførte produktet som azure I og hevdet at bare deres versjon var autentisk Giemsa-farging.

To verdenskriger fullførte arbeidet ved en tilfeldighet. Da tyske fargestoffer ikke lenger var tilgjengelige, arbeidet Lillie, Roe og Wilcox med amerikanske erstatninger og fant at den beste fargingen kom fra tre separerte komponenter: rent metylenblått, nedbrytningsproduktet azure B, og eosin. Disse tre er fortsatt hovedkomponentene i fargemetoden som brukes til å diagnostisere malaria i dag, under et navn som nå knytter Malachowski, Wright og Giemsa sammen.

Figur: ringformer av Plasmodium falciparum i menneskelige røde blodceller, farget med en Romanowsky-type metode. Den lilla strukturen inne i ringen er kromatinet som Malachowskis boraksbehandlede metylenblått gjorde synlig for første gang. Bilde av Ernst Hempelmann, frigitt til offentlig eiendom.

Ett navn, flere materialer

Årene som skilte disse komponentene, etterlot et problem som varte lenger enn kjemien. Ralph Lillie trakk i 1969 skillet mellom biologiske fargestoffer, "produsert etter strenge spesifikasjoner som svarer til deres følsomme og krevende bruksområder", og ikke-biologiske fargestoffer til tekstilfarging, som "krever mindre strenge og krevende produksjonsstandarder". Begge produkttypene bar samme navn, og forskjellen mellom dem var aldri bare et spørsmål om grad. En spesifikasjon skrevet for bomull og en spesifikasjon skrevet for et diagnostisk reagens er ikke utskiftbare, og et materiale fremstilt etter tekstilspesifikasjonen var ikke ment å svelges.

Azure B er den tydeligste illustrasjonen. Det er den monodemetylerte formen av metylenblått, det har målbar farmakologisk aktivitet i seg selv, og det var til stede som en ukontrollert bestanddel i kliniske preparater av metylenblått i mer enn et århundre før noen skilte de to. Én gruppe fant at menneskelig vev tatt ved obduksjon etter administrasjon av metylenblått inneholdt 5 til 14 per cent uforandret metylenblått og 86 til 95 per cent azure B. Om et bestemt preparat skal inneholde azure B, og hvilken grense som i så fall skal gjelde, er et spesifikasjonsspørsmål, og forskningen på azure B som urenhet og metabolitt tar opp tråden derfra.

Det er også i spesifikasjonen den praktiske konsekvensen ligger. USP-samsvar er veien til den høyeste renheten markedet tilbyr, fordi det er en fullstendig publisert teststandard og ikke én enkelt måling. Den dekker identitet, analyse, organiske urenheter inkludert azurfargestoffene, restløsemidler, elementære urenheter, gløderest, mikrobielle grenser og bakterielle endotoksiner. Et sertifikat som oppgir et resultat for tungmetaller og kaller det USP-samsvar, har bare rapportert én linje fra denne listen.

Blupreme skaffer metylenblått fra en farmasøytisk produsent og publiserer hele analysesertifikatet, med testing av hele USP-spesifikasjonen i stedet for bare tungmetaller. Veiledningen til hvordan et analysesertifikat leses og hva USP-betegnelsen fastslår og ikke fastslår forklarer hvordan dokumentet kan kontrolleres mot påstanden.

Hva historien gir grunnlag for, og hva den ikke gjør

Historikken er reell, og den er lengre enn de fleste produktsider antyder. Metylenblått ble brukt til å behandle malaria i 1891, ble rapportert brukt som beroligende middel ved agitert psykose i 1899, og sidekjeden derfra går gjennom kinakrin, klorokin, prometazin og klorpromazin. Ehrlichs artikkel fra 1890 sammen med Arthur Leppmann beskrev lindring av nevralgiske og revmatiske smerter, og vurderte deretter, men avsto fra, å teste fargestoffet ved psykisk sykdom.

Ingenting av dette fastslår en moderne bruk. Malariaresultatet fra 1891 besto av to pasienter og en temperaturkurve. Lang erfaring med et molekyl er en grunn til å studere det, ikke et resultat. Historien til forbindelsen som legemiddel og moderne studier av malaria besvarer andre spørsmål enn dem Ehrlich stilte, og endepunktene må vurderes på sine egne premisser.

Én detalj i dokumentasjonen hører til nåtiden snarere enn fortiden. Da forskere gjennomførte malariastudier med metylenblått i Burkina Faso på 2000-tallet, opplevde de konkurranse om materiale av farmasøytisk kvalitet og rapporterte at prisen på råmaterialet hadde steget med en faktor på omtrent hundre etter at det fikk GMP-validering. Et fargestoff kunne erstattes. Et legemiddel kunne ikke. Skillet Lillie trakk i 1969, er det samme skillet som avgjør hva en flaske inneholder i dag.