L-istorja tal-blu tal-metilin: minn żebgħa għal mediċina u riċerka

Il-blu tal-metilin wasal għand pazjent qabel ma wasal fi spiżerija.

Ir-rapport tal-1891 ta’ Paul Guttmann u Paul Ehrlich dwar l-użu taż-żebgħa fil-malarja fih żewġ graffs tat-temperatura. It-tieni wieħed ikopri mit-13 ta’ Lulju sal-5 ta’ Awwissu, bit-trattament miktub tul il-marġni jum b’jum. L-entrati tat-18 u d-19 ta’ Lulju jgħidu "1 × 0,05 Methylenblau". Il-jiem ta’ wara jelenkaw ħames u seba’ dożi tal-istess ammont, u sat-22 ta’ Lulju kwantità żgħira ta’ quinine kienet ingħaqdet mar-rekord. Il-linja tad-deni, li titla’ u tinżel bejn 37 °C u 39.5 °C matul l-ewwel nofs tal-graff, tiċċattja wara li tidher iż-żebgħa u tibqa’ bejn madwar 36 °C u 37.5 °C għat-tliet ġimgħat li jifdal.

Il-pazjent kien wieħed minn tnejn, deskritti fl-artiklu bħala qaddej domestiku u baħri. Il-kompost li ngħataw kien ilu ħmistax-il sena żebgħa kummerċjali għat-tessuti, u ż-żewġt irġiel huma fost l-ewwel persuni rreġistrati li ġew ittrattati b’mediċina kompletament sintetika mmirata lejn organiżmu speċifiku.

Iż-żebgħa ġiet l-ewwel

L-ewwel żebgħa sintetika ta’ suċċess kummerċjali nħolqot minn William Henry Perkin fl-1856. Perkin kellu tmintax-il sena, kien qed jaħdem f’laboratorju fid-dar matul il-vaganzi tal-Għid, u kien qed jipprova jissintetizza l-quinine. Minflok kiseb residwu iswed, ħallu f’soluzzjoni, u sab kulur li jaqbad b’mod brillanti mal-ħarir. Irreġistra privattiva għalih f’Awwissu tal-1856 u sal-aħħar tal-1857 kellu fabbrika li kienet tforni impjant taż-żebgħa tal-ħarir f’Londra.

Fl-1875 Adolf von Baeyer issintetizza żebgħa ħamra u semmieha eosin, minn Eos, il-kelma Griega għaż-żerniq. Fl-1876 Heinrich Caro, dak iż-żmien direttur tal-laboratorju ta’ Badische Anilin- und Soda-Fabrik, żviluppa l-blu tal-metilin ma’ Baeyer bħala żebgħa bbażata fuq l-anilina għall-qoton. L-istruttura kimika tiegħu ma ġietx stabbilita qabel madwar disa’ snin wara.

Dik l-oriġini għadha tidher fil-mod kif is-sustanza tissejjaħ. "Methylene blue" huwa isem kummerċjali mill-katalgu taż-żebgħa, mhux deskrizzjoni kimika. Il-kompost li għalih jirreferi huwa l-klorur tal-metiltioninju, u d-differenzi bejn l-isem, il-melħ, u l-idrati tiegħu jibdew jgħoddu malli xi ħadd jiżen il-materjal jew jaqra speċifikazzjoni.

It-tbajja’ kienet il-pont

It-triq mill-impjanti taż-żebgħa għall-isptar għaddiet mill-mikroskopju, u bdiet qabel ma kien jeżisti l-blu tal-metilin. Wilhelm Erb kien l-ewwel persuna li applika żebgħa sintetika għad-demm, billi uża aċidu pikriku fl-1865, u ra mudell retikulari ġewwa xi ċelloli ħomor.

It-teżi tad-dottorat ta’ Paul Ehrlich tal-1878 qabblet it-tbajja’ istoloġika maż-żebgħa tat-tessuti u sostniet li t-tnejn kienu reazzjonijiet kimiċi. Waqt li kien jaħdem taħt Robert Koch fuq il-bacillus tat-tuberkulożi, huwa kklassifika ż-żebgħat tal-anilina fi klassijiet aċidużi u bażiċi u stabbilixxa li kull klassi kienet tagħti kulur lil partijiet differenti ta’ ċellola. Fl-1880 ħallathom flimkien: soluzzjoni saturata ta’ blu tal-metilin tferrgħet f’acid fuchsin sakemm is-supernatant iċċara. Ir-riżultat, li sejjaħlu neutralen Farbkörper jew tbajja’ newtrali, ipproduċa tliet kuluri minflok wieħed, wera granuli fiċ-ċelloli polimorfonukleari li ma kinux viżibbli qabel, u għamel possibbli l-ewwel għadd differenzjali tal-lewkoċiti. Minħabba li dawk il-granuli assorbew iż-żewġ komponenti tat-taħlita, Ehrlich ħoloq il-kelma newtrofilu għaċ-ċelloli li kien fihom dawn il-granuli.

Sentejn wara Koch uża l-blu tal-metilin biex isib il-bacillus tat-tuberkulożi, u fl-1883 Ehrlich tejjeb il-metodu. Fl-1886 ippubblika tip differenti ta’ osservazzjoni: injetta ż-żebgħa f’annimali ħajjin u qabbel kemm kull organu kien jassorbiha b’mod qawwi, u kkonkluda li kellha affinità qawwija għat-tessut tal-moħħ u tan-nervituri. Huwa attribwixxa dik l-affinità għaċ-ċiklu ta’ ossidazzjoni-tnaqqis taż-żebgħa, li kien osserva s-sena ta’ qabel. Dak iċ-ċiklu huwa wkoll ir-raġuni għaliex soluzzjoni ta’ blu tal-metilin titlef il-kulur tagħha meta jiġi kkunsmat l-ossiġnu tagħha u terġa’ tikseb il-kulur meta jerġa’ jidħol l-arja. L-esperimenti li l-ewwel kejlu l-konsegwenzi ta’ dak iċ-ċiklu jappartjenu għal deċennju aktar tard, u l-mekkaniżmu nnifsu huwa suġġett separat mill-istorja.

Il-parassita u n-nukleu vjola

Alphonse Laveran sab il-parassita tal-malarja fl-1880 billi eżamina demm frisk u mhux imtebba’. Biex dan ikun jista’ jidher regolarment f’smear imnixxef kienet meħtieġa tbajja’, u t-tbajja’ ta’ dak iż-żmien kienet tipproduċi biss aħmar u blu.

Fl-1888 il-patologu Pollakk Czesław Cheçinski ssostitwixxa l-acid fuchsin bl-eosin, u pproduċa taħlita ta’ blu tal-metilin u eosin. Il-każ li wassal għall-metodu tiegħu kien ta’ suldat li miet bil-malarja fit-30 ta’ Settembru 1887. Fil-films tad-demm Cheçinski ra forom blu bħal margeriti, li llum huma rikonoxxuti bħala Plasmodium malariae, u forom f’għamla ta’ minġel, li llum huma rikonoxxuti bħala l-gametoċiti ta’ Plasmodium falciparum. Ir-riżultat temm żewġ spjegazzjonijiet rivali tal-marda f’daqqa: it-teorija tal-mijażma, u l-allegazzjoni ta’ Edwin Klebs u Corrado Tommasi-Crudeli li l-malarja kienet ikkawżata minn batterju.

Il-parassita kienet viżibbli. In-nukleu tagħha ma kienx, u għalhekk in-natura tagħha baqgħet miftuħa għall-interpretazzjoni. Ernst Malachowski, tabib fi Breslau, solva dik il-problema l-ewwel b’kumbinazzjoni u mbagħad apposta. Fl-1889 innota tbajja’ differenzjali tan-nukleu plasmodjali f’preparazzjoni u ma setax jirriproduċiha. Li jagħmel il-blu tal-metilin aktar aċiduż ma għenx. Li jagħmlu aktar alkalin bil-borax ipproduċa l-effett kull darba. Huwa wera t-teknika pubblikament fil-15 ta’ Ġunju 1890 u ppubblikaha fl-istess sena, b’metodu aktar sħiħ f’Awwissu tal-1891.

Dmitri Romanowsky ippubblika l-verżjoni tiegħu stess f’Settembru tal-1891. L-aħjar riżultati tiegħu ġew minn flixkun ta’ soluzzjoni ta’ blu tal-metilin li kien tħalla għal żmien twil, kien imħammeġ bil-moffa u kellu aktar minn xahrejn. Id-deskrizzjoni ta’ Malachowski kienet intenzjonata u, fi kliemu, faċilment riproduċibbli; dik ta’ Romanowsky kienet triq mejta li ħadmet darba. Minkejja dan, l-eponimu ngħata lil Romanowsky, u t-tilwima dwar min ipproduċa l-vjola li għamlet in-nukleu viżibbli hija storja separata bid-dokumenti tagħha stess.

Figura: it-tieni graff tat-temperatura mir-rapport tal-1891 ta’ Guttmann u Ehrlich. Il-parti ta’ fuq tkopri mit-13 sal-24 ta’ Lulju u l-parti t’isfel mill-25 ta’ Lulju sal-5 ta’ Awwissu; l-entrati fil-marġni jsemmu d-dożi mogħtija, u t-temperatura tibqa’ qrib in-normal għall-aħħar tliet ġimgħat tar-rekord. Riprodott mir-rapport kif ġie skennjat għal Krafts, Hempelmann u Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Ir-ripening irriżulta li kien demetilazzjoni

Ħadd minn dawk involuti fis-snin 1890 ma kien jaf x’kien jagħmel ir-"ripening" lill-blu tal-metilin. It-tweġiba ħarġet mill-kimika industrijali. Heinrich August Bernthsen kien issintetizza l-kompost ġenitur phenothiazine fl-1883, stabbilixxa fl-1885 li l-blu tal-metilin kien jappartjeni għal dik il-familja, u fl-istess perjodu wera li kundizzjonijiet alkalini jneħħu gruppi methyl miż-żebgħa, u jipproduċu l-komposti li llum jissejħu azures.

Bernard Nocht estratta l-frazzjoni attiva fl-1898 u l-1899 u seta’ jsejħilha biss Rot aus Methylenblau, aħmar mill-blu tal-metilin. Michaelis identifikaha bħala azure I fl-1901. Jenner introduċa methanol assolut bħala solvent għall-preċipitat taż-żebgħa fl-1899, u b’hekk neħħa l-ħtieġa li l-films tad-demm jiġu ffissati bis-sħana; Leishman u Reuter għaqqdu ż-żewġ avvanzi; Wright ippubblika metodu ssimplifikat fl-1902. Il-kontribut ta’ Giemsa, ukoll fl-1902, kien li jieqaf jiddependi fuq soluzzjoni li kienet immaturat b’mod aleatorju u minflok juża kwantitajiet imkejla ta’ żebgħat magħrufa. Imbagħad irrifjuta li jippubblika kif kien jagħmel methylene azure pur u biegħ il-metodu lil-laboratorju ta’ Dr. Grübler, li kkummerċjalizza l-prodott bħala azure I u sostna li l-verżjoni tiegħu biss kienet tbajja’ Giemsa awtentika.

Żewġ gwerer dinjija temmew ix-xogħol b’kumbinazzjoni. Meta ż-żebgħat Ġermaniżi ma setgħux jibqgħu jinkisbu, Lillie, Roe u Wilcox ħadmu fuq is-sostituti Amerikani u sabu li l-aħjar tbajja’ kienet tiġi minn tliet komponenti separati: blu tal-metilin pur, il-prodott tat-tkissir tiegħu azure B, u eosin. Dawn it-tlieta għadhom il-komponenti ewlenin tat-tbajja’ użata llum biex tiġi dijanjostikata l-malarja, taħt isem li issa jgħaqqad flimkien Malachowski, Wright u Giemsa.

Figura: forom ta’ ċirku ta’ Plasmodium falciparum fiċ-ċelloli ħomor umani, imtebbgħin b’metodu tat-tip Romanowsky. L-istruttura vjola ġewwa ċ-ċirku hija l-kromatina li l-blu tal-metilin ittrattat bil-borax ta’ Malachowski għamel viżibbli għall-ewwel darba. Immaġni ta’ Ernst Hempelmann, rilaxxata fid-dominju pubbliku.

Isem wieħed, diversi materjali

Is-snin li sseparaw dawk il-komponenti ħallew problema li damet aktar mill-kimika. Ralph Lillie għamel id-distinzjoni fl-1969 bejn tbajja’ bijoloġiċi, "manifatturati skont speċifikazzjonijiet stretti proporzjonati mal-użi delikati u eżiġenti tagħhom", u tbajja’ mhux bijoloġiċi għall-kulur tat-tessuti, li "jeħtieġu standards tal-manifattura inqas rigorużi u eżiġenti". Iż-żewġ tipi ta’ prodott kellhom l-istess isem, u d-differenza bejniethom qatt ma kienet sempliċement waħda ta’ grad. Speċifikazzjoni miktuba għall-qoton u speċifikazzjoni miktuba għal reaġent dijanjostiku ma jistgħux jintużaw minflok xulxin, u materjal magħmul skont dik tat-tessuti ma kienx maħsub biex jinbela’.

Azure B huwa l-aktar eżempju ċar. Huwa l-forma monodemetilata tal-blu tal-metilin, għandu attività farmakoloġika tiegħu stess li tista’ titkejjel, u kien preżenti bħala kostitwent mhux ikkontrollat fi preparazzjonijiet kliniċi ta’ blu tal-metilin għal aktar minn seklu qabel ma xi ħadd issepara t-tnejn. Grupp wieħed sab li tessut uman meħud waqt awtopsja wara l-amministrazzjoni tal-blu tal-metilin kien fih 5 sa 14 fil-mija blu tal-metilin mhux mibdul u 86 sa 95 fil-mija Azure B. Jekk preparazzjoni partikolari għandhiex ikun fiha Azure B, u f’liema limitu, hija kwistjoni ta’ speċifikazzjoni, u r-riċerka dwar Azure B bħala impurità u metabolit tkompli minn hemm.

Speċifikazzjoni hija wkoll fejn jinsab l-effett prattiku. Il-konformità mal-USP hija t-triq lejn l-ogħla purità li joffri s-suq, għax hija standard komplut u ppubblikat ta’ ttestjar aktar milli kejl wieħed. Tkopri l-identità, l-assay, impuritajiet organiċi inklużi ż-żebgħat azure, solventi residwi, impuritajiet elementali, residwu wara l-inkinerazzjoni, limiti mikrobijoloġiċi, u endotossini batteriċi. Ċertifikat li jirrapporta riżultat għall-metalli tqal u jsejjaħlu konformità mal-USP ikun irrapporta linja waħda biss minn dik il-lista.

Blupreme jikseb il-blu tal-metilin tiegħu mingħand manifattur farmaċewtiku u jippubblika ċ-ċertifikat sħiħ tal-analiżi, billi jittestja l-ispeċifikazzjoni kollha tal-USP aktar milli l-metalli tqal biss. Il-gwida għall-qari ta’ ċertifikat tal-analiżi u x’jistabbilixxi u x’ma jistabbilixxix l-indikazzjoni USP jispjegaw kif id-dokument għandu jiġi ċċekkjat kontra l-pretensjoni.

X’tippermetti l-istorja, u x’ma tippermettix

Il-linja storika hija reali, u hija itwal milli jimplikaw ħafna paġni tal-prodotti. Il-blu tal-metilin intuża fit-trattament tal-malarja fl-1891, ġie rrappurtat bħala sedattiv fi psikożi b’aġitazzjoni fl-1899, u l-katina laterali tiegħu tgħaddi minn quinacrine, chloroquine, promethazine u chlorpromazine. L-artiklu tal-1890 ta’ Ehrlich ma’ Arthur Leppmann iddeskriva serħan minn uġigħ newralġiku u rewmatiku, u mbagħad ikkunsidra iżda ddeċieda li ma jittestjax iż-żebgħa fil-mard mentali.

Xejn minn dan ma jistabbilixxi użu modern. Ir-riżultat tal-malarja tal-1891 kien jikkonsisti f’żewġ pazjenti u graff tat-temperatura. Familjarità twila ma’ molekula hija raġuni biex tiġi studjata, mhux riżultat. L-istorja tal-kompost bħala mediċina u l-provi moderni fil-malarja iwieġbu mistoqsijiet differenti minn dawk li kien qed jistaqsi Ehrlich, u l-endpoints iridu jinqraw skont it-termini tagħhom stess.

Hemm dettall wieħed fir-rekord li jappartjeni għall-preżent aktar milli għall-passat. Meta r-riċerkaturi wettqu provi tal-blu tal-metilin għall-malarja fil-Burkina Faso fis-snin 2000, sabu ruħhom jikkompetu għal materjal ta’ grad farmaċewtiku, u rrappurtaw li l-prezz tal-materja prima kien żdied b’fattur ta’ madwar mitt darba ladarba kellha validazzjoni GMP. Żebgħa setgħet tiġi sostitwita. Mediċina ma setgħetx. Id-distinzjoni li għamel Lillie fl-1969 hija l-istess waħda li llum tiddeċiedi x’fih flixkun. :::