Метиленско сино и митохондрии: електронски транспорт и доказите

Замислете два препарата еден до друг. И двата содржат митохондрии од мозок, затруени со ротенон, хемикалија што го блокира комплексот I на респираторниот синџир. Во едниот, експериментаторот со пипета додава микромоларна доза метиленско сино. Потрошувачката на кислород делумно се враќа. Мембранскиот потенцијал делумно се обновува. Повторно започнува мала синтеза на ATP. Во соседната кивета, сензор за пероксид ја открива другата половина од приказната: создавањето водороден пероксид се зголемило повеќекратно, при секоја испитана доза и со секој испробан супстрат.

И двете мерења се точни. Метиленското сино е преносник на електрони што може да го одржува текот на електроните заобиколувајќи оштетен дел од респираторниот синџир, но истиот преносник притоа наплаќа цена во вид на пероксид. Ако ги имате предвид двете факти истовремено, литературата за метиленското сино и митохондријалната функција станува разбирлива. Ако го земете предвид само едниот, таа изгледа како приказна за чудо или за закана, зависно од тоа кој труд сте го отвориле прв.

Преносот на електрони, едноставно објаснет

Респираторниот синџир е низа за штафетен пренос. Електроните влегуваат кај комплексот I (од NADH) или кај комплексот II и сродните флавински ензими (од сукцинат и слични донори), минуваат преку комплексот III до подвижниот носач цитохром c, а потоа преку комплексот IV до кислородот. При секое предавање се пумпаат протони низ внатрешната мембрана, а добиениот градиент ја движи синтезата на ATP. Блокирајте која било станица и делот од низата пред неа престанува да работи.

Метиленското сино се вклучува како паралелен курир. Неговата оксидирана форма прима електрони од носачите порано во синџирот и преминува во безбојната редуцирана форма, леукометиленско сино, која потоа ги предава тие електрони понатаму во синџирот и повторно станува сина. Двете форми се опишани во објаснувањето на редокс-парот, а поширокото однесување при преносот е обработено во општото објаснување на механизмот. Отвореното прашање е каде курирот повторно се вклучува во низата: во џебот за врзување на хинол во комплексот III, познат како местото Qo, или директно кај цитохром c. Кој излез преовладува зависи од условите, како што детално објаснува анализата на заобиколувањето на комплексот III.

Што всушност измериле трите студии со глодачи

Сите три студии користеле изолирани митохондрии од мозок, односно органели отстранети од клетката и суспендирани во пуфер со дефиниран состав. Без цели клетки, без животни на кои им е дадена доза, без човечки испитаници. Концентрациите се однесуваат на растворот околу органелите, а не на орална доза за човек. Ако ја задржите оваа рамка, бројките зборуваат јасно.

Првата студија, со изолирани митохондрии од мозок на заморчиња при концентрации од 100 наномолари до 2 микромолари, ги утврдила користа и цената во еден препарат. Во здрави митохондрии, бојата ја зголемила потрошувачката на кислород во мирување, но не ја променила респирацијата стимулирана со ADP, па спрегнатото создавање ATP не се подобрило. При блокада на комплексот I, 2 микромолари ја вратиле синтезата на ATP од 46 на 93 наномоли во минута на милиграм, наспроти нормална стапка од околу 1109. При блокада на комплексот III, истата доза го вратила создавањето ATP од околу 46 на 63, наспроти нормална стапка од околу 910. Потенцијалот и внесувањето калциум делумно се обновиле. Блокадата на комплексот IV со цијанид не можела да се заобиколи, што го сместува корисниот излез на електроните пред функционалниот комплекс IV. Секое враќање на функцијата било статистички значајно и мало: едноцифрени проценти од нормалното создавање ATP.

Втората студија, со митохондрии од мозочната кора на глувци при околу 1 микромолар, го потврдила заобиколувањето на комплексот I и утврдила граница кај комплексот III. Ротенонот ја намалил респирацијата од околу 121 на под 2 наномоли кислород во минута на милиграм, а бојата ја зголемила на околу 21, приближно една шестина од нормалната вредност, додека мембранскиот потенцијал се обновил речиси целосно. Но по блокадата на комплексот III, ниту респирацијата ниту потенцијалот не се обновиле во опсегот од 1 до 5 микромолари, а блокадата го потиснала пероксидниот сигнал предизвикан од бојата. Авторите предложиле дека редуцираната боја ги предава своите електрони на местото Qo на комплексот III: кога тоа место е зафатено, курирот нема каде да ги предаде.

Третата студија, со митохондрии од мозок на глувци, стаорци и заморчиња, главно при 2 микромолари, директно го испитала несогласувањето и утврдила дека блокадата на комплексот III може да се премости. Кога миксотиазолот, инхибитор на местото Qo, ја намалил базалната респирација за 88 проценти, бојата ја вратила потрошувачката на кислород на околу 62 проценти од стапката без блокада. Во директен тест, половина микромолар редуцирал егзоген цитохром c дури и додека комплексот III бил блокиран, што ја поддржува патеката од NADH преку бојата до цитохром c и понатаму до комплексот IV. Но обновената респирација се однесувала ненормално: додавањето ADP ја намалувало потрошувачката на кислород наместо да ја зголеми, а блокирањето на синтезата на ATP ја стимулирало респирацијата. Потенцијалот се обновил со реполаризација само делумно. Високата потрошувачка на кислород со обратна спрегнатост не е нормално производство на енергија.

Зошто лабораториите не се согласуваат и што го разрешува тоа

Прво отпаѓа објаснувањето засновано на разликите меѓу видовите. Третата група ја повторила работата кај три вида глодачи и добила ист квалитативен резултат на заобиколување кај сите нив, вклучително и кај сојот глувци кај кој претходно било пријавено дека заобиколувањето отсуствува. Наместо тоа, се разликуваат концентрацијата (1 наспроти 2 микромолари), дозите на инхибиторите, пуферите, методите на изолација и, пред сè, енергетската состојба што се споредува: заобиколувањето е најјасно пред додавањето ADP, токму каде што се појавува парадоксалниот одговор на ADP. Затоа веродостојниот дијаграм прикажува два излеза зависни од условите, еден кај местото Qo и еден кај цитохром c. Курирот ги предава електроните таму каде што локалната хемија му го дозволува тоа.

Цената во вид на пероксид

Наодите за цената се исто толку доследни како и наодите за враќањето на функцијата. Во студијата со заморчиња, бојата го зголемила ослободувањето пероксид при секоја испитана состојба: во мирување, при синтеза на ATP и при хемиски нарушена функција, со сите три супстрати. За време на синтезата на ATP, создавањето се зголемило од околу 148 на над 1500 пикомоли во минута на милиграм при 1 микромолар, а дури и 100 наномолари го зголемиле сигналот повеќе од четирикратно. Бојата го забавила и отстранувањето на пероксидот приближно 2.6 пати, па сигналот одразува побрзо создавање и побавно отстранување. Предложениот хемиски механизам е директна редукција на кислородот од редуцираната боја, без детектибилен супероксид, иако тоа останува толкување, а не докажан чекор.

Студијата со глувци ја усложнува сликата на корисен начин. Пероксидот нагло се зголемувал со дозата, од почетна вредност од околу 76 на речиси 2000 пикомоли во минута на милиграм при 2 микромолари, но блокадата на комплексот III ја потиснала компонентата предизвикана од бојата. Ако пероксидот потекнувал само од реакцијата на редуцираната боја со кислородот, блокирањето на синџирот не би требало да има толкаво влијание. Но има, што значи дека и синџирот учествува. Прегледот на антиоксидантното и прооксидантното дејство ја сместува оваа двојност во поширок контекст, а анализата на кислородот наспроти ATP објаснува зошто бројките за кислородот сами по себе никогаш не се доволни за да потврдат тврдење за енергијата.

Враќањето на функцијата не е поправка

Изразот што треба да престане да се користи е „дали метиленското сино ги поправа митохондриите“. Поправка би значело трајно исправување: обновени комплекси, спрегнатост што се задржува откако лекот ќе се отстрани, обновување во цели клетки, а потоа подобрена функција во жив организам. Ниту еден од трите труда не го покажува тоа. Тие покажуваат акутно пренасочување во свежо изолирани органели за време на вештачка хемиска блокада, со создавање ATP што е мал дел од нормалното и понекогаш со очигледно необична спрегнатост. Ротенонот и антимицинот се лабораториски алатки, а не модели на стареење или на човечка митохондријална болест, и ништо од ова не може да се преточи во повеќе енергија за здрав човек. Тоа е посебно прашање за доказите со сопствена литература за истражувања кај луѓе.

Три ограничувања го одржуваат веродостоен секој заклучок за биохакинг. Прво, концентрацијата во растворот не е доза: 0.1 до 2 микромолари околу изолирани органели не кажува ништо за тоа кое орално количество ја создава таа слободна концентрација кај митохондрија во човечкиот мозок, особено бидејќи бојата се акумулира или се ослободува во зависност од самиот мембрански потенцијал. Второ, кислородот не е енергија: бојата може да ја зголеми потрошувачката на кислород преку циклични реакции и истекување, како и преку продуктивна фосфорилација, па респирометријата без мерења на ATP и потенцијалот не може да оправда тврдење за енергијата. Трето, користа и товарот мора да бидат во иста реченица: секое тврдење за обновен потенцијал или ATP што го изоставува придружното зголемување на пероксидот погрешно го претставува експериментот. Поврзани ограничувања се разгледани во редокс-рамнотежата на NAD, обликот на одговорот на дозата и водичот за анализи.

Една практична забелешка: преносот на електрони е својство на конкретната молекула. Деметилираните сродни соединенија, како Azure B, исто така се редокс-активни, но се однесуваат поинаку, па делумно разграден раствор претставува поинаков експеримент од оној со неразградена боја. Тоа е една од причините да се инсистира на целосната фармакопејска спецификација и на објавен документ за серијата, наместо само на проверка за метали. Хемиските реакции поттикнати од светлина додаваат уште едно предупредување за употреба при осветлување, обработено во комбинациите со црвена светлина.

Тесното тврдење опстојува и покрај сето ова и вреди да се задржи: метиленското сино може, зависно од условите, да дејствува како курир на електрони во оштетени изолирани митохондрии, делумно зачувувајќи го текот по цена на пероксид. Сè што оди подалеку од тоа — енергија, долговечност, поправка — чека докази што овие студии никогаш не биле осмислени да ги дадат.