Paulis Ehrlichas ir metileno mėlynasis: kaip dažiklis padėjo formuoti vaistų paiešką

Paulio Ehrlicho indėlis į mediciną buvo ne vaistas. Tai buvo argumentas, kaip reikėtų į vaistą žvelgti.

1878 metais jis pateikė daktaro disertaciją, kurios pirmasis skyrius vadinosi „Cheminė dažymo samprata“. Jame teigta, kad audinio pjūvio dažymas ir tekstilės skiautės dažymas grindžiami ta pačia logika. Abiem atvejais spalva prisitvirtina dėl cheminio dažiklio ir medžiagos giminingumo, o ne todėl, kad audinys yra sugeriantis, riebus ar tokios formos, kuri sulaiko pigmentą. Ehrlichas užaugo stebėdamas, kaip jo pusbrolis, patologas Karlas Weigertas, ruošia dažytus pjūvius, ir jo dėmesį traukė ne vaizdai, o tai, kad dažiklis pasirinkdavo, kur patekti.

Šis teiginys skamba kukliai. Tačiau toks nėra. Jei dažiklis jungiasi prie audinio dėl cheminių priežasčių, tuomet dažymo vaizdas suteikia informacijos apie to audinio chemines savybes. Dažytas preparatas nustoja būti iliustracija ir tampa matavimo priemone.

Šią mintį jis iš karto plėtojo. 1880 metais metileno mėlynąjį sumaišė su rūgštiniu fuksinu ir mišinį pavadino neutraliu dažikliu, neutralen Farbkörper. Jis leido atskirti skirtingus baltųjų kraujo kūnelių tipus ten, kur tuo metu naudoti pavieniai dažikliai to negalėjo. Po dvejų metų jis pristatė tuberkuliozės bacilų dažymo metilvioletu metodą, o Kochas šią procedūrą pritaikė savo darbe.

Teorija, vėliau suteikusi šioms praktikoms bendrą pagrindą, yra atskiras klausimas, o jos atsiradimo data dažnai pernelyg supaprastinama. Ehrlicho šoninių grandinių teorija — mintis, kad medžiaga veikia ląstelę, nes jos abi chemiškai dera, — priklauso 1890-iesiems, o ne eksperimentų su dažikliais laikotarpiui. Ankstesni darbai suteikė pradinį įsitikinimą: selektyvumas yra cheminis, todėl jo galima kryptingai ieškoti, o ne atsitiktinai aptikti.

Eksperimentas, pavertęs dažiklį žemėlapiu

1885 metais Ehrlichas išleido monografiją apie organizmo deguonies poreikį, kurios paantraštė ją apibūdino kaip spalvinės analizės tyrimą. Metodo esmė buvo švirkšti dažiklius, kurių spalva priklauso nuo oksidacijos būsenos, ir tada palyginti, kaip skirtingi organai juos redukuoja arba išlaiko nepakitusius. Dažiklis buvo naudojamas kaip instrumentas, panašiai kaip termometras: jis rodė sąlygas audinio viduje, kurių nebuvo galima tiesiogiai ištirti. Pats Ehrlichas tikslą apibrėžė kaip siekį, pasitelkus tam tikrus dažiklius, nustatyti gyvų organų redukuojamąją gebą.

Rezultatas su metileno mėlynuoju pasirodė 1886 metais straipsnyje apie dažiklio reakciją su gyvąja nervine medžiaga, pristatytame medicinos draugijai ankstesnių metų gruodį. Metileno mėlynasis buvo įleidžiamas į gyvo gyvūno kraujotaką, o tada paimami ploni audinio pjūviai ir veikiami oru, kad susikaupęs bespalvis dažiklis oksiduotųsi, vėl taptų mėlynas ir parodytų, kur susikaupė. Nervinės ląstelės ir nervinės skaidulos nusidažė pakankamai selektyviai, kad ši technika tapo standartiniu nervinio audinio išryškinimo metodu. Junginys nebebuvo tik dažomoji medžiaga, laboratorijoje tepama ant negyvo audinio pjūvio. Jis tapo žymeniu, kuris pasiskirstė gyvo kūno viduje, o tą pasiskirstymą buvo galima perskaityti.

Abiejų eksperimentų pagrindą sudarančią savybę verta įvardyti aiškiai, nes nuo jos priklauso visa likusi istorija. Metileno mėlynojo kitimas yra grįžtamasis. Jo redukuota forma, leukometileno mėlynasis, yra bespalvė, o susilietusi su deguonimi vėl virsta mėlynu katijonu. Dažiklio tirpalas su gliukoze sandariai uždarytame inde yra bespalvis; atidarius indą, jis pamėlynuoja. Teigiama, kad Ehrlichas tai parodė tiesiogiai, dažytus pjūvius veikdamas geležies chloridu ir oru bei stebėdamas, kaip grįžta spalva. Dažiklis, kurio spalva kinta priklausomai nuo aplinkos oksidacijos ir redukcijos būsenos, yra tos aplinkos tyrimo zondas.

Taigi greta buvo dvi savybės. Dažiklis galėjo atskirti vieną audinį nuo kito. Be to, pasikeitus oksidacijos būsenai, dažiklį buvo galima įjungti ir išjungti.

Žvelgiant retrospektyviai, antroji savybė yra chemoterapijos pradžia. Jei junginys prisijungia prie vieno tipo audinio, bet ne prie kito, tas pats junginys galbūt galėtų pasiekti vieno tipo organizmą, bet ne kitą. Ehrlichas šią išvadą suformulavo tiesiogiai: jei patogeną galima nudažyti selektyviai, dažymas galėtų rodyti specifinį žalingą poveikį tam patogenui. Taigi dažiklį galbūt būtų galima naudoti kaip vaistą, nukreiptą į įsibrovėlį, o ne į pacientą.

Pirmasis bandymas su pacientu buvo skirtas ne maliarijai. 1890 metais Ehrlichas kartu su psichiatru Arthuru Leppmannu pranešė, kad metileno mėlynasis malšina neuralginį ir reumatinį raumenų, sąnarių bei sausgyslių skausmą. Abu svarstė, ar vaistas galėtų veikti psichikos ligas, ir nusprendė jo nebandyti. Italų gydytojas Pietro Bodoni iš Genujos vis dėlto tai išbandė. Jo 1899 metų straipsnio pavadinime minimas raminamasis poveikis sergant įvairiomis psichozės formomis: jis aprašė keturiolikos sujaudintų pacientų nurimimą ir pažymėjo, kad kiti Genujos gydytojai jau naudojo dažiklį tuo pačiu tikslu. Sedacija nėra poveikis pačiai ligai, ir ši skirtis šioje istorijoje vis pasikartoja.

Maliarijos tyrimas vyko 1891 metais kartu su patologu Pauliu Guttmannu Berlyno Moabit ligoninėje. Metileno mėlynasis buvo duotas dviem pacientams, o ataskaita pasirodė 1891 metų rugsėjo 28 dienos Berliner klinische Wochenschrift numeryje. Pirmuoju atveju pacientas birželio 29 dienos vakarą vienu kartu išgėrė 0.5 g dažiklio; lauktas priepuolis nepasireiškė visa apimtimi, o vienintelis vėliau užfiksuotas nusiskundimas buvo lengva strangurija ir mėlynas šlapimas. Karščiavimo priepuoliai išnyko per pirmąsias dienas, o parazitų kraujyje nebeliko vėliausiai aštuntą dieną. Patys autoriai apibendrino, kad jų lūkesčiai visiškai pasiteisino. Du atvejai be kontrolinės grupės nėra įrodymas. Išsamesnis pasakojimas apie metileno mėlynąjį ir maliariją, įskaitant šiuolaikinius tyrimus, pateikiamas atskirame puslapyje, o čia įdomus siauresnis klausimas: kiek Ehrlicho samprotavimų atlaikė susidūrimą su parazitu.

Kur samprotavimai pasitvirtino, o kur ne

Iš siūlyto veikimo mechanizmo išliko nedaug, bent jau tokio, kokį jį pateikė Ehrlichas. Tvarkinga versija, pagal kurią plokščias triciklis katijonas įsiterpia tarp parazito DNR bazių porų, Plasmodium atveju nepasitvirtina. Užkrėstas eritrocitas metileno mėlynąjį redukuoja taip lengvai, kad jis parazito apskritai nepasiekia kaip plokščias katijonas, o akridino dažikliams tinkantis interkaliacijos paaiškinimas šiam dažikliui netinka.

Įrodymais pagrįstas vaizdas ne toks tvarkingas. Metileno mėlynasis slopina parazito glutationo reduktazę esant koncentracijoms, kurias galima pasiekti paciento organizme. Jis blokuoja hemo virtimą hemozoinu — inertiniu pigmentu, kurį parazitas formuoja, kad neapsinuodytų savo paties virškinamo hemoglobino produktais, — maždaug taip pat veiksmingai kaip chlorokvinas ir gerokai veiksmingiau nei chininas. Jo oksidacijos ir redukcijos ciklas taip pat sukuria reaktyviąsias deguonies formas ląstelėje, kuri jas jau gamina. Kuris iš šių procesų yra tikrasis veikimo mechanizmas, ar prie poveikio prisideda visi, vis dar nėra galutinai nustatyta.

Yra ir dar viena aplinkybė, kuri turėtų lemti, kaip vertinamas bet kuris istorinis teiginys apie šį junginį. To laikotarpio komercinis metileno mėlynasis nebuvo viena medžiaga. Mėginiuose buvo Azure B, vieną metilo grupę praradusio giminingo junginio, o senesniuose tirpaluose jo susikaupdavo daugiau. Azure B yra metachromatinis dažiklis, turintis kitokius taikinius: dvigrandę DNR jis nudažo tamsiai mėlynai, o RNR — žaliai. Dviejų dažiklių, patenkančių į skirtingas vietas ir sumaišytų niekieno neužfiksuotomis proporcijomis, mišinys neleidžia aiškiai teigti, ką padarė jame esantis metileno mėlynasis.

Pats dažiklis niekada neišstūmė chinino. Metodui sekėsi geriau. Ehrlicho mokinys Wilhelmas Roehlas, dirbęs dažiklių ir vaistų koncerne IG Farben, toliau plėtojo dažiklių darinius kaip vaistus tropinėms ligoms ir suteikė trūkstamą priemonę: paukščių maliarija užkrėstą kanarėlę kaip įprastą kandidatinių junginių atrankos modelį. Tada Werneris Schulemannas pakeitė šoninę grandinę, o gauta fenotiazinio druska išgydė eksperimentinę infekciją. Ji vis dar nudažydavo pacientus mėlynai.

Ilgalaikį pėdsaką paliko ne dažiklis ir ne žiedų sistema, o šoninė grandinė. Pridėjus dialkilaminoalkilamino grupę, molekulės elgsena pasikeitė, o šis fragmentas išliko po visų vėlesnių pertvarkymų. Išlaikius tą grupę ir fenotiazinio žiedą pakeitus akridino žiedu, gaunamas kvinakrinas. Pakeitus jį chinolino žiedu, gaunamas chlorokvinas. Pamachinas, primachinas ir amodiachinas, visi tebesantys vaistų nuo maliarijos sąraše, turi tą pačią grupę. Junginys, kuris nepasiteisino kaip gydymo priemonė, suteikė pasiteisinusį fragmentą.

Ryšys su antipsichoziniais vaistais eina per žiedą, o ne per patį vaistą. Būtent metileno mėlynojo struktūros išaiškinimas 1883 metais Heinrichą Augustą Bernthseną atvedė prie bazinio fenotiazino branduolio, o šį molekulinį karkasą, įvairiai keičiant jo pakaitus, XX amžiaus 1940-aisiais tyrinėjo Rhône-Poulenc chemikai, ieškodami antihistamininių vaistų. Vienas iš šių junginių buvo susintetintas maždaug 1950 metų pabaigoje ir išbandytas chirurgo Henri Laborit, kuris pastebėjo, kad pacientai po jo tapdavo ramūs ir abejingi. Pirmasis publikuotas jo panaudojimas psichiatrijoje, pacientui, kuriam pasireiškė manija, datuojamas 1952 metų sausiu. Pirmasis antipsichozinis vaistas yra ne tiek Ehrlicho vaisto nuo maliarijos palikuonis, kiek tolimas dažiklio, nuo kurio jis pradėjo, giminaitis.

Trys įpročiai, kuriuos verta perimti iš šio epizodo

1. „Pirmasis medicinoje naudotas sintetinis vaistas“ apibūdina kategoriją, o išlygų yra daugiau, nei leidžia suprasti ši frazė. Frazė tapo įprasta; dažnai cituojamoje Schirmerio ir kolegų apžvalgoje žurnale Neurobiology of Aging metileno mėlynasis vadinamas pačiu pirmuoju visiškai sintetiniu medicinoje naudotu vaistu. Chloralio hidratas kaip sintetinis raminamasis vaistas pradėtas naudoti 1869 metais, daugiau nei dvidešimt metų anksčiau. Pats 1891 metų straipsnis pateikia dalį atsakymo, nes jo autoriai įvardija sintetinius karščiavimą mažinančius vaistus, kurie jau buvo nepasiteisinę prieš maliariją, tarp jų chinoliną, antipiriną ir antifebriną. Paties Ehrlicho arseno junginio pagrindu sukurtas vaistas nuo sifilio atsirado dar vėliau. Pagrįsta šio teiginio versija susijusi su metodu, o ne pirmumu: metileno mėlynasis yra vienas ankstyviausių sintetinių junginių, pasirinktų veikti konkretų organizmą remiantis chemine selektyvumo teorija.
2. Selektyvus pasiskirstymas nėra selektyvi nauda. Ehrlicho 1886 metų rezultatas buvo tas, kad dažiklis patenka į nervinį audinį. Kur junginys patenka ir ką jis ten daro, yra du skirtingi matavimai, o pirmąjį atlikti gerokai lengviau. Šioje spragoje nuo tada gyvuoja dauguma teiginių apie metileno mėlynąjį ir smegenis.
3. Grynumas yra įrodymų, o ne rinkodaros dalis. Istoriniai duomenys dviprasmiški būtent dėl šios priežasties. Nedideli struktūros skirtumai keičia tai, kur šis junginys patenka, todėl analizės sertifikatas turi būti susietas su konkrečia partija, o ne pateikiamas kaip bendras teiginys, kad produktas yra ištirtas. Pardavėjas, deklaruojantis atitiktį farmakopėjos monografijai, bet tikrinantis tik sunkiuosius metalus, teigia daugiau, nei pagrindžia ataskaita. Blupreme metileno mėlynąjį įsigyja iš farmacijos gamintojo ir tikrina visus monografijoje nustatytus specifikacijos rodiklius: tapatybę, grynumą, organines priemaišas, tirpiklių likučius, elementines priemaišas, kaitinimo liekaną, mikrobiologines ribas ir bakterinius endotoksinus. Ataskaita skelbiama kartu su produktu, o puslapyje apie USP kokybės metileno mėlynąjį paaiškinamos šios ribos ir kodėl pirmiausia reikėtų ieškoti Azure B tyrimo rezultato.

Chronologinis šaltinių pėdsakas

Chronologinė svarbiausių įvykių seka, įskaitant iki Ehrlicho plėtotą dažiklių chemiją ir po jo atsiradusias kokybės kategorijas bei specifikacijas, atskirai pateikiama metileno mėlynojo istorijoje, o paties junginio tapatybė aptariama puslapyje kas yra metileno mėlynasis.

Šį pasakojimą pagrindžiančios iliustracijos, atkurtos 2012 metų Krafts, Hempelmann ir Skórska-Stania apžvalgoje, nėra lygiavertės, ir vienas pavyzdys parodo kodėl. 1891 metų iliustracija yra pirminis tyrimo dokumentas; šalia esantis 1910 metų portretas leidžia datuoti reputaciją ir nieko daugiau. Andersago 1934 metų užrašų knygelės puslapiai yra tiesioginis chinolino žiedo pakeitimo pėdsakas, užrašytas paties chemiko ranka.

Sąžiningai apibendrinant Ehrlicho eksperimentus su dažikliais, jis teisingai nustatė selektyvumą ir taikinį, bet suklydo dėl mechanizmo. Metileno mėlynasis iš tiesų kaupiasi nerviniame audinyje ir iš tiesų kenkia maliarijos parazitui. Tačiau antrasis poveikis nekyla iš pirmojo, o jo pasiūlytas cheminis abiejų reiškinių paaiškinimas buvo klaidingas. Tai, ką jis neginčijamai parodė, buvo ilgaamžiškiau už teisingą mechanizmą: junginį galima ne atsitiktinai rasti, o pasirinkti, ir pasirinkti remiantis įrodymais, surinktais dar prieš kam nors jį duodant pacientui.