Metileno mėlynasis ir žarnyno mikrobiomas: tyrimo su pelėmis duomenys

Metileno mėlynasis gali pakeisti pelių išmatose nustatomą bakterijų profilį. Šis rezultatas nepatvirtina, kad jis gerina žmogaus žarnyno sveikatą, selektyviai pašalina kenksmingas bakterijas ar gydo disbiozę. Esminis skirtumas yra tarp mikroorganizmų bendrijos pakeitimo ir organizmo šeimininko sveikatos pagerinimo.

Tiesiogiai su šiuo klausimu susijusiame eksperimente su pelėmis buvo tiriama bakterijų DNR ir užduoties atlikimas labirinte. Tokie matavimai gali atskleisti dėsningumus, kuriuos verta tirti toliau. Tačiau vien jų nepakanka nustatyti, kad bakterijų pokytis sukėlė elgsenos pokytį arba kad kuris nors iš šių pokyčių leidžia numatyti virškinimo simptomų palengvėjimą.

Ką iš tiesų matavo tyrėjai

Gureevo ir kolegų 2020 m. eksperimente trijų mėnesių C57Bl/6 pelės keturias savaites gavo metileno mėlynojo po 15 mg/kg/day (devynios pelės), po 50 mg/kg/day (aštuonios) arba kontrolinį vandenį (13). Eksperimento plano skyriuje nėra aiškiai nurodytas preparato vartojimo būdas ar gyvūnų lytis.

Išmatų mėginiai buvo imami prieš pradedant skirti preparatą ir kas savaitę. Tyrėjai naudojo bakterijų grupių qPCR ir papildomą 16S DNR amplikonų sekoskaitą. Per paskutines penkias dienas pelėms buvo skirtos dvi pripratimo dienos, po kurių tris dienas vyko bandymai T formos labirinte su atlygiu; kasdien buvo vertinama po dešimt pasirinkimų.

Tai eksperimentinės ekspozicijos pelėms, o ne žmonėms rekomenduojamos dozės. Vartojimo būdas svarbus vertinant, kiek preparato pasiekia žarnyną, o jei jis nenurodytas, nereikėtų jo numanyti. Perskaičiavimas pagal kūno svorį nepatvirtintų saugaus ar veiksmingo vartojimo režimo žmogui.

Mikrobiomo tyrimo įrodymų lentelė

Šioje originalioje lentelėje pateikti stebėjimai atskiriami nuo platesnių teiginių, su kuriais gali susidurti skaitytojas. Bakterijų grupių pavadinimai atitinka straipsnyje vartojamą terminiją.

Įrodymų lygmuo	Stebėjimas arba matavimas	Interpretavimo ribos
Bakterijų profilis esant mažesnei ekspozicijai	Skiriant 15 mg/kg/day, pakito tam tikros grupės; Delta/Gammaproteobacteria padaugėjo anksti, o ketvirtą savaitę jų neaptikta.	Tyrimo pabaigoje paimtas mėginys gali neatskleisti ankstesnių pokyčių. Neaptikimas priklauso nuo tyrimo metodo.
Bakterijų profilis esant didesnei ekspozicijai	Skiriant 50 mg/kg/day, ketvirtą savaitę Proteobacteria dalies mediana buvo 7.49%, palyginti su 1.61% kontrolinėje grupėje.	Procentinės dalies padidėjimas nepatvirtina absoliutaus gyvų ląstelių skaičiaus padidėjimo.
Taksonominės detalės	Sekoskaita atskleidė pokyčius plačių bakterijų grupių viduje.	Stabili bendra bakterijų tipo dalis gali slėpti jo narių pokyčius.
Organizmo šeimininko elgsena	Mažesnė ekspozicija pagerino bendrus T formos labirinto rezultatus; didesnė ekspozicija jų nepagerino.	Tai konkrečios užduoties atlikimo rezultatas, o ne išsamus pažintinių gebėjimų vertinimas.
Sąsaja	Deferribacteres neigiamai koreliavo su antros dienos rezultatais.	Koreliacija nenustato priežastinio organizmo ar mechanizmo.
Žarnyno funkcija	Tiesiogiai nevertinti žarnyno barjero ar metabolitų rodikliai.	Tyrimas negali patvirtinti atkurto normalaus pralaidumo ar pagerėjusios mikroorganizmų funkcijos.
Priežastingumo tikrinimas	Neatliktas mikrobiotos perkėlimo ar jos kiekio sumažinimo eksperimentas.	Lieka neaišku, ar mikroorganizmai tarpininkavo poveikiui elgsenai.

Lentelė sąmoningai suskirstyta pagal tai, kas buvo matuojama. Palankus atsakymas vienoje eilutėje negali užpildyti atsakymo spragos kitoje. Pavyzdžiui, geresnis užduoties atlikimas labirinte nesuteikia trūkstamų įrodymų apie žarnyno uždegimą.

Kodėl bakterijų procentinės dalys neparodo, kas buvo sunaikinta

Terminas santykinis gausumas apibūdina grupės dalį tiriamoje bendrijoje. Tai nėra tas pats, kas bakterijų ląstelių skaičius viename grame išmatų. Savo kiekybinio mikrobiomo profiliavimo tyrime Vandeputte ir kolegos parodė, kodėl bendras mikroorganizmų kiekis svarbus interpretuojant bendrijų skirtumus.

Įsivaizduokite pavyzdinį mėginį, kuriame yra dešimt organizmo A vienetų ir 90 kitų organizmų vienetų. A sudaro 10%. Jei A kiekis lieka dešimt, o kitų sumažėja iki 40, A jau sudaro 20%. Jo dalis padvigubėjo, nors absoliutus kiekis nepadidėjo. Šis aritmetinis pavyzdys nėra metileno mėlynojo eksperimento rezultatas.

Tas pats skirtumas riboja teiginius apie bakterijų naikinimą. Pagal DNR nustatyta proporcija nėra tiesioginis išgyvenamumo tyrimas. Norint nustatyti gyvybingų bakterijų sumažėjimą, eksperimente reikia matavimų, kurie įvertintų gyvybingumą ir bendrą populiacijos dydį. Norint nustatyti funkcinį pokytį, reikia atitinkamo funkcinio matavimo, pavyzdžiui, išmatuoto metabolito, o ne prognozės, pagrįstos vien bakterijų pavadinimais.

Plačios kategorijos taip pat slepia biologinę įvairovę. Vertinant visą bakterijų tipą kaip naudingą arba žalingą, neatsižvelgiama į konkrečius organizmus ir jų veiklą, lemiančią tam tikrą rezultatą. Todėl santykio pokytis savaime nėra disbiozės diagnozė ar įrodymas, kad disbiozė išgydyta.

Ar mikrobiomas paaiškino rezultatą labirinte?

Eksperimente preparato ekspozicija, bakterijų profilis ir elgsena buvo vertinami tame pačiame tyrime. Tai naudinga keliant hipotezę. Mūsų vertinimu, toks tyrimo planas neleidžia atskirti kelių galimų paaiškinimų: tiesioginio preparato poveikio elgsenai, netiesioginio mikroorganizmų poveikio arba atskirų elgsenos ir bakterijų reakcijų į tą pačią ekspoziciją.

Įtikinamesniame tarpininkavimo eksperimente siūlomas mikrobinis tarpininkas būtų keičiamas nepriklausomai nuo preparato. Tyrėjai galėtų patikrinti, ar perkėlus apibrėžtą bendriją perduodamas ir poveikis, arba ar pašalinus numanomą mikrobinį mechanizmą poveikis išnyksta. Tokiems eksperimentams taip pat reikia kontrolės, leidžiančios įvertinti, kas dar perkeliama ar pakeičiama.

Elgsenos rodiklį reikia vertinti taip pat atsargiai. Labirinte su atlygiu gyvūnas turi rinktis konkrečiomis sąlygomis. Vertinant svarbu atsižvelgti į tai, kad užduoties atlikimas gali priklausyti nuo noro tyrinėti, judėjimo, motyvacijos gauti atlygį ir mokymosi. Rezultatą pavadinus „geresniais pažintiniais gebėjimais“, šie skirtumai supaprastinami. Tiesiogiai matuotos užduoties aprašymas išlieka informatyvesnis.

Ar metileno mėlynasis naikina žarnyno bakterijas?

Metileno mėlynasis gali dalyvauti antimikrobiniame procese apibrėžtomis laboratorinėmis sąlygomis. Tai nepasako, kas nutinka visai žarnyno bendrijai, kai medžiaga vartojama per burną.

Pavyzdžiui, laboratoriniame fotodinaminio bakterijų inaktyvinimo tyrime E. coli ir S. aureus buvo tiriamos naudojant fotosensibilizatorius ir kontroliuojamą apšvietimą. Buvo vertinamas kolonijų susidarymas bei membranų pažeidimas ir įtrauktos atitinkamos kontrolinės grupės tamsoje. Vien šviesa arba vien fotosensibilizatorius tomis tirtomis sąlygomis poveikio neturėjo.

Šios kontrolinės grupės tame eksperimente atsako į svarbų priežastingumo klausimą: koks buvo abiejų veiksnių derinio indėlis? Medžiagos nurijimas neatkuria bakterijų suspensijos apšvietimo sąlygų. Kita vertus, neigiamas kontrolinio bandymo tamsoje rezultatas esant vienai koncentracijai ir trukmei neįrodo, kad bet kokia ekspozicija be apšvietimo yra biologiškai neaktyvi. Antimikrobinių tyrimų apžvalgoje paaiškinami šie nuo sąlygų priklausantys skirtumai.

Žarnyno bendrijos tyrimas taip pat negali patvirtinti konkrečios infekcijos gydymo. Organizmo nustatymas ir tinkamo klinikinio rezultato įrodymas yra atskiros užduotys, taip pat ir vertinant teiginius apie parazitų gydymą.

Ką tai reiškia teiginiams apie žmogaus žarnyno sveikatą

Atliekant tikslinę literatūros paiešką šiam straipsniui, nerasta kontroliuojamo žmogaus žarnyno mikrobiomo tyrimo, patvirtinančio metileno mėlynojo naudą žarnyno sveikatai. Tai teiginys apie rastus įrodymus, o ne įrodymas, kad nėra jokio susijusio tyrimo. Vietinio fotodinaminio burnos gydymo tyrimai su žmonėmis nagrinėja kitą klausimą: pavyzdžiui, 45 asmenų halitozės tyrime buvo imami liežuvio apnašų mėginiai ir matuojamos iškvepiamo oro dujos, o ne vertinama žarnyno sveikata.

Norint pagrįsti teiginį apie žmogaus žarnyno sveikatą, tyrime reikėtų apibrėžtos tiriamųjų populiacijos, atkuriamos preparato sudėties ir vartojimo būdo, tinkamos palyginimo grupės bei tai populiacijai svarbaus rezultato. Mikroorganizmų profilis galėtų padėti paaiškinti rezultatą, tačiau vis tiek reikėtų įvertinti simptomų pagerėjimą, ligos kontrolę ir nepageidaujamą poveikį.

Keturios savaitės viename pelių modelyje taip pat neleidžia nustatyti mėnesius ar metus trunkančio vartojimo pasekmių. Kasdienės ir ilgalaikės metileno mėlynojo ekspozicijos apžvalgoje gydymo trukmė atskiriama nuo stebėjimo ir saugumo rodiklių. Norėdami susipažinti su platesniu klinikiniu kontekstu, skaitykite, ką pagrindžia tyrimai su žmonėmis.