Kaip metileno mėlis patenka į ląsteles: redukcija, pakartotinė oksidacija, įsisavinimas

Stebint, kaip lėkštelėje esančios endotelio ląstelės įsisavina metileno mėlį, akivaizdi interpretacija kartu yra ir klaidinga. Terpė praranda mėlyną spalvą, ląstelėse atsiranda mėlynų granulių, tad atrodo, kad dažiklis turėjo pereiti per membraną kaip mėlyna molekulė. Eksperimentai rodo ką kita. Mėlyna forma beveik neprasiskverbia. Per membraną pereina bespalvė forma, o viduje matomas mėlis susidaro jau patekęs į ląstelę.

Šis požiūrio apvertimas svarbus, nes nuo jo priklauso, ką nusidažymas gali ir ko negali atskleisti. Mėlynos granulės rodo oksiduotą dažiklį, kuris buvo pakartotinai oksiduotas ir sulaikytas organelėse. Jos neparodo bendro dažiklio kiekio ląstelėje, neparodo redukuotos formos kiekio ir nematuoja biologinio poveikio. Kad suprastume kodėl, atsekime tris etapus: redukciją paviršiuje, redukuotos formos difuziją, pakartotinę oksidaciją ir sulaikymą viduje.

Dvi formos elgiasi tarsi skirtingos molekulės

Oksiduotas metileno mėlis yra plokščia, teigiamą krūvį turinti žiedų sistema. Jis tirpsta vandenyje, stipriai sugeria šviesą maždaug nuo 600 iki 700 nanometrų diapazone ir atrodo mėlynas. Esminis dalykas yra krūvis. Krūvį turinti hidrofilinė molekulė nelengvai prasiskverbia per lipidinę membraną, todėl literatūroje atsargiai rašoma, kad membrana jai yra santykinai nepralaidi, o ne visiškai nepralaidi.

Redukuotas metileno mėlis, vadinamas leukometileno mėliu, yra bespalvis, neturi krūvio ir tirpsta riebaluose. Pašalinus krūvį, membrana nustoja būti siena. Redukuota molekulė lengvai difunduoja per ją, o patekusi į labiau oksiduojantį ląstelės skyrių gali vėl prarasti elektronus ir grįžti į mėlyną, krūvį turinčią, sulaikomą formą. Taigi dažiklio oksidacijos ir redukcijos chemija kartu yra ir jo pernašos mechanizmas. Pakeitus elektronų skaičių, pasikeičia ir gebėjimas prasiskverbti per membraną.

Pirmajam etapui reikalingi elektronai ateina iš pačios ląstelės. Žinduolių ląstelės perneša elektronus per plazminę membraną, perduodamos redukuojančius ekvivalentus iš ląstelės viduje esančių donorų paviršiuje esantiems akceptoriams. Ši elektronų pernaša per plazminę membraną yra įprasta ląstelės funkcija, būdinga daugumai ląstelių tipų. Tiazino dažiklius redukuojanti endotelio paviršiaus reduktazė vienu iškalbingu aspektu elgiasi kaip ir kitos: ji toliau veikia esant tokioms cianido ir azido koncentracijoms, kurios sustabdo vėlesnius etapus. Šis procesų atskyrimas yra viso paaiškinimo pagrindas.

Pirmiausia buvo pasiskirstymo modelis, ir jis beveik paaiškino įsisavinimą

1929 metais Marian Irwin iš Rokfelerio instituto iškėlė paprastesnį klausimą. Galbūt dažiklio patekimas tėra jo pasiskirstymas tarp vandens ir riebalinių ląstelės sluoksnių, o laboratorijoje tuos riebalinius sluoksnius gali atstoti chloroformo sluoksnis. Atlikdama spektrofotometrinius prasiskverbimo tyrimus, ji kratė vandeninius dažiklių tirpalus su chloroformu ir lygino, kas pereina į organinę fazę, su tuo, kas patenka į gyvas dumblių ląsteles.

Du šio darbo rezultatai tebėra verti dėmesio. Pirma, komerciniuose metileno mėlio tirpaluose buvo trimetiltionino, dabar vadinamo Azure B, ir ši priemaiša prasiskverbdavo greičiau nei pats metileno mėlis, ypač esant šarminiam pH, kai vyrauja lipiduose tirpi laisvosios bazės forma. Kai kuriais atvejais tariamas metileno mėlio patekimas iš tikrųjų buvo selektyvus Azure B patekimas. Antra, pH lėmė rezultatą, nes nustatė jonizacijos būseną, o pažeistos ląstelės įsileisdavo gerokai daugiau dažiklio nei nepažeistos. Pasiskirstymo koeficientai ir krūvio būsena lėmė, ką įsisavina dirbtinė sistema ir gyva ląstelė, o jų panašumas palaikė mintį, kad ląstelės riboje yra nevandeninių sluoksnių.

Modelis įžvalgiai numatė lipidų ir jonizacijos svarbą, tačiau negalėjo atskirti dažiklio, kuris pasiskirsto nepakitęs, nuo dažiklio, kuris paviršiuje chemiškai paverčiamas kita forma, pereina per membraną tarsi užsimaskavęs ir viduje vėl paverčiamas pradine forma. Tam reikėjo kitokio eksperimento, ir jis buvo atliktas po septyniasdešimties metų su plaučių endoteliu.

Redukcija išorėje, sulaikymas viduje

Merker ir kolegos dirbo su kultivuojamomis galvijų plaučių arterijų endotelio ląstelėmis ir pasiūlė trijų etapų seką: oksiduotas dažiklis ląstelės paviršiuje redukuojamas iki bespalvės lipofilinės formos, redukuota forma difunduoja į vidų, o pakartotinė oksidacija ląstelės viduje atkuria oksiduotą formą, kuriai membrana nepralaidi ir kuri kaupiasi. Savo tiazino dažiklių įsisavinimo endotelyje tyrime jie patikrino šią seką mėgindami ją nutraukti konkrečiuose etapuose.

Pirmoji priemonė buvo fericianidas – elektronų akceptorius, negalintis patekti į ląstelę. Kai paviršiaus fermentai už ląstelės ribų redukuoja mėlyną dažiklį iki bespalvės formos, fericianidas gali atimti tuos elektronus ir vėl atkurti mėlyną dažiklį terpėje, dar prieš jam pereinant per membraną. Kol fericianido buvo perteklius (10 mikromolių dažiklio litre ir nuo 50 iki 500 mikromolių fericianido litre), dažiklio įsisavinimas beveik sustodavo ir tik sunaudojus fericianidą vėl vykdavo įprastu greičiu. Kinetika tą patį patvirtino kitu būdu. Fericianidas nyko maždaug pastoviu greičiu, o tai atitiko pastovų redukcijos paviršiuje srautą, palaikantį pakartotinai naudojamą tarpininką. Tuo tarpu už ląstelės ribų esančio dažiklio kiekis mažėjo eksponentiškai, senkant jo atsargai. Pastovus srautas ir senkanti atsarga reiškia, kad fericianido signalas rodo nenutrūkstamą redukciją, o ne dažiklio molekulių pasitraukimą iš tirpalo.

Antroji priemonė visiškai pašalino perėjimo per membraną etapą. Tyrėjai prijungė toluidino mėlio O, artimo tiazino dažiklių giminaičio, molekules prie didelės poliakrilamido grandinės, kuri buvo per didelė patekti į ląstelę esant bet kuriai oksidacijos būsenai. Ląstelės vis tiek redukavo prijungtą dažiklį. Vadinasi, redukcijai nereikia patekti į ląstelės vidų. Redukcijos mechanizmas yra paviršiuje arba elektriškai su juo susietas.

Tada buvo atskirti procesai, nuo kurių kilo straipsnio pavadinimas. Cianidas ir azidas, kurių koncentracija buvo 2 milimoliai litre, stipriai slopino dažiklio kaupimąsi, o mikroskopu matomi tamsiai mėlyni ir violetiniai intarpai, paprastai supantys branduolį, beveik išnyko. Tačiau nė vienas inhibitorius nesulėtino redukcijos už ląstelės ribų: fericianido ciklas vyko nesusilpnėjęs, o per membraną neprasiskverbiantis polimeras tebebuvo redukuojamas. Blokavimas veikė vėlesniame etape. Cianidas ir azidas stabdė pakartotinę oksidaciją ir sulaikymą ląstelės viduje, o ne redukciją paviršiuje. Gyvybingumo kontroliniai bandymai patvirtino šį aiškinimą: šių procedūrų metu ląstelės išlaikė savo citozolinį žymeninį fermentą laktatdehidrogenazę, todėl įsisavinimo sumažėjimo nebuvo galima paaiškinti vien toksiniu poveikiu ar membranos plyšimu.

Vienas straipsnyje išsakytas perspėjimas tebėra aktualus. Mėlyni intarpai buvo aplink branduolį, bet ne jame, o tai atitiko oksidaciją ląstelės organelių viduje, tačiau tyrimas nenustatė, kuriose organelėse ji vyko. Panašūs vaizdai kitų tipų ląstelėse buvo priskirti lizosomoms remiantis menkais įrodymais. Sulaikymą laikykite nustatytu, o tikslią jo vietą – dar nepatvirtinta. Skaitytojai, norintys atsekti tolesnį elektronų kelią, gali pereiti prie mitochondrijų elektronų pernašos ir oksidacijos bei redukcijos procesų ir platesnio absorbcijos bei pasiskirstymo pagal patekimo būdą vaizdo.

Nusidažymas nėra ekspozicijos matas

Trečias tyrimas parodo, kas nutinka, kai ši įsisavinimo logika susiejama su biologiniu rodikliu. Scott ir kolegos nustatė, kad metil-beta-ciklodekstrinas, žiedo formos cukraus toras, tiesiogiai jungiasi su metileno mėliu. Inkliuzinio komplekso susidarymo asociacijos konstanta buvo maždaug 310 atvirkštinių molių litre, palyginti su maždaug 5846 atvirkštiniais moliais litre dažiklio dimerizacijos atveju. L929 fibroblastuose šis jungimasis blokavo ir ląstelių nusidažymą, ir gliukozės įsisavinimo skatinimą: išankstinė inkubacija su ciklodekstrinu neleido atsirasti mėlynam nusidažymui, o jo pridėjimas vėliau paspartino spalvos išnykimą. Silpstant optiniam mėlynos spalvos signalui ląstelėse, beveik lygiagrečiai silpo ir suaktyvėjusi gliukozės pernaša.

Autoriai šią koreliaciją laikė labiau palaikančia tiesioginę dažiklio sąveiką su baltymu gliukozės nešiklio aktyvinimo kelyje nei ilgalaikio oksidacinio streso mechanizmą. Ši išvada pagrįsta, tačiau ribota. Eksperimentas neįvardija baltymo, neparodo jungimosi su pačiu nešikliu, o koreliacija tarp spalvos išnykimo ir poveikio praradimo neatmeta visų oksidacijos bei redukcijos procesų nulemtų kelių.

Esminė išliekanti pamoka susijusi su matavimu. Optinis nusidažymas rodo matomą, oksiduotą, su ląstele susijusį dažiklį. Bespalvė redukuota forma lieka visiškai nepastebėta, todėl blyškioje ląstelėje vis tiek gali būti dažiklio ekvivalentų, o intensyviai nusidažiusi ląstelė rodo sulaikytą oksiduotą dažiklį, o ne bendrą audinio ekspoziciją ar poveikio dydį. Tas pats perspėjimas galioja ir platesniu mastu: lyginant skirtingų tipų ląstelių nusidažymą arba tamsų audinio pjūvį laikant didesnės ekspozicijos įrodymu, kartojama pradinė klaida, padaryta stebint lėkštelę. Įsisavinimas yra redukcijos, difuzijos ir pakartotinės oksidacijos ciklas, o bet kuris pavienis mėlynos formos vaizdas atskleidžia tik vieną jo dalį. Iš to tiesiogiai kyla praktinės pasekmės laboratoriniam dažymui ir darbui su dažikliu bei teiginių apie dozę ir ekspoziciją vertinimui.