Dažymas metileno mėliu: mikroskopijos metodai ir tikrų vaizdų atlasas

Dažymas metileno mėliu padeda šviesaus lauko mikroskopijoje lengviau atskirti menkai matomus ląstelių požymius. Jis gali padėti mokiniams rasti žando ląstelės branduolį arba apžiūrėti mikroorganizmų kontūrus ir išsidėstymą. Tačiau mėlynas objektas tėra stebėjimo rezultatas. Nustatyti, koks tai organizmas, jį išmatuoti ir nuspręsti, ar jis rodo ligą, yra atskiros užduotys.

Viršelio vaizdas iliustruoja kontrasto principą. Toliau pateiktame atlase yra tikros nepriklausomai dokumentuotų mėginių nuotraukos su pradinių šaltinių informacija.

Ką išryškina metileno mėlis?

Metileno mėlis yra bazinis dažiklis: jo spalvotasis jonas turi teigiamą krūvį. Kaip OpenStax aiškina skyriuje apie mėginių dažymą, baziniai dažikliai sąveikauja su neigiamą krūvį turinčia ląstelių medžiaga ir gali padėti ląstelėms išsiskirti šviesesniame fone. Tinkamai paruoštuose preparatuose metileno mėlis išryškina sritis, kuriose gausu nukleorūgščių, ir kitas dažiklį surišančias struktūras.

Dažant paprastuoju būdu, kontrastą suteikia vienas dažiklis. Todėl skirtingi organizmai gali atrodyti mėlyni, nors jie nėra tas pats organizmas. Iš pradžių naudinga kelti aprašomuosius klausimus: ar objektai apvalūs, ar pailgi, pavieniai ar susitelkę į grupes, vienodai nusidažę ar turintys skirtingai nusidažiusių vidinių sričių? Prieš laikydami spalvą klasifikavimo rezultatu, susipažinkite su paprastojo dažymo ir dažymo Gramo būdu skirtumais.

Kontrastas ir skiriamoji geba yra skirtingi dalykai. Kontrastas padeda atskirti objektą nuo aplinkos, o skiriamoji geba leidžia atskirti arti viena kitos esančias detales. Tamsesnis vaizdas negarantuoja, kad bus įžiūrima daugiau atskirų struktūrų. Taip pat ne kiekvieną tamsią granulę galima vadinti organele.

Natyviniai preparatai, dažyti drėgnieji preparatai ir tepinėliai

Nedažytas, arba natyvinis, drėgnasis preparatas leidžia stebėti vaizdą be pridėto dažiklio, nors išėmimas iš pradinės aplinkos vis tiek pakeičia mėginį. Ruošiant dažytą drėgnąjį preparatą, reagentas pridedamas medžiagai tebesant skystyje po dengiamuoju stikleliu. Ruošiant fiksuotą tepinėlį, medžiaga paskleidžiama ant objektinio stiklelio ir prieš tolesnį apdorojimą fiksuojama nurodytu metodu. OpenStax preparatų ruošimo apžvalgoje atskiriami drėgnieji preparatai ir fiksavimas bei paaiškinama, kodėl fiksuoti organizmai nebeleidžia stebėti įprasto judėjimo ar medžiagų apykaitos.

Šie preparatai padeda atsakyti į skirtingus klausimus:

Palyginimui per pamoką pirmiausia užfiksuokite nedažyto preparato vaizdą, o tada apžiūrėkite atskirai pagal mokymo protokolą paruoštą dažytą preparatą. Naudokite palyginamus apšvietimo ir vaizdo fiksavimo nustatymus. Jei fotografuojamos dvi skirtingos ląstelės, aprašykite jas kaip pavyzdžius, o ne kaip vienos ląstelės vaizdus prieš dažymą ir po jo.

Mikroskopijos atlasas: trys tikri dažyti mėginiai

Šis atlasas yra originali trijų pagal atvirąsias licencijas pateiktų mikrofotografijų atranka ir interpretacija. Šaltinių autoriai nurodo mėginius ir dažiklius. Mes nepriklausomai nepatvirtinome jų mėginių tapatybės. Vaizdai atkartojami neapkarpyti, konvertuoti į WebP formatą be nuostolių, nepridėjus jokių elementų ir nepakeitus spalvų.

1 iliustracija: žmogaus žando ląstelės

Mėginys: žmogaus žando ląstelės. Dažiklis: metileno mėlis. Didinimas: 400×, kaip nurodė fotografas. Mastelio juosta: nėra; šaltinyje nepateiktas kalibruotas pikselio dydis. Fritzmann2002 nuotrauka, 2017, iš Žmogaus žando ląstelės (dažymas metileno mėliu), pateikta pagal CC BY-SA 4.0 licenciją. Šiai reprodukcijai taikoma ta pati licencija.

Pradėkite nuo atskirai esančios ląstelės: jos tamsesnį branduolį lengviau atskirti nuo aplinkinės mėlynos citoplazmos. Tada apžiūrėkite po ja esančias persidengiančias ląsteles. Dėl persidengimo sunkiau atsekti ribą ir gali susidaryti vietinė tamsesnė sritis. Naudokite šią iliustraciją mokydamiesi atsekti kontūrus, o ne skaičiuodami kiekvieną tamsią dėmę kaip branduolį. Žando ląstelių stebėjimo vadove išsamiau pateikiama šiam mėginiui skirta užduotis.

2 iliustracija: svogūno ląstelės

Mėginys: svogūno ląstelės, kaip nurodyta šaltinyje. Dažiklis: metileno mėlis. Didinimas: pradiniame failo pavadinime yra „200x“; jis nėra nepriklausomai patvirtintas. Mastelio juosta: nėra; kalibravimo duomenys nepateikti. Alvy16 nuotrauka, 2019, iš Svogūno ląstelė 200x, pateikta pagal CC BY 4.0 licenciją.

Pailgos ertmės sudaro tvarkingą sluoksnį. Palyginkite jų ilgas bendras ribas su netaisyklingais kontūrais 1 iliustracijoje. Taip pat atkreipkite dėmesį į ryškią tamsią medžiagą ir netolygų regėjimo lauko šviesumą. Nuotrauka neleidžia nustatyti, kas yra kiekviena tamsi nuosėda. Ji parodo, kodėl naudingame stebėjimo apraše nurodomi artefaktai ir neapibrėžtumas, užuot įvardijus viską, kas nusidažo.

3 iliustracija: mielės, šaltinyje įvardytos kaip Candida spp.

Mėginys: Candida spp., kaip nurodė fotografė. Dažiklis: paprastasis teigiamas dažymas metileno mėliu. Didinimas: nenurodytas. Mastelio juosta: nėra; kalibruotas pikselio dydis nepateiktas. Martos, Wikimedia naudotojos Martunia.g, nuotrauka, 2021, iš Teigiamas dažymas metileno mėliu 2, pateikta pagal CC BY 4.0 licenciją.

Palyginkite tankias mėlynas sankaupas su retesniais pakraščiais. Atskirų objektų kontūrus lengviau atsekti ten, kur jie mažiau persidengia. Pavadinimas Candida paimtas iš šaltinio aprašo, o ne nustatytas identifikuojant rūšį pagal šią nuotrauką. Ši iliustracija taip pat nepateikia gyvybingumo tyrimo rezultato. Mielių gyvybingumo ir kvėpavimo tyrimams reikia atskirų sąlygų, kontrolinių mėginių ir interpretacijos.

Kaip teisingai suprasti mastelį

Šios iliustracijos tinka vaizdiniam palyginimui, bet ne matavimams mikrometrais ar absoliutaus ląstelių dydžio palyginimui tarp iliustracijų. Nurodytas didinimas neatstoja trūkstamų kameros kalibravimo duomenų. Pakeitus rodomo vaizdo dydį, pasikeičia jo matomas padidinimas.

Savo vaizdams atlikite matavimo kalibravimą naudodami žinomą etaloną ir atitinkamą optinę konfigūraciją. Nikon mikrometrijos vadove aiškinama, kaip objektinis mikrometras leidžia sutartines vaizdo ar okuliaro tinklelio padalas perskaičiuoti į fizinius ilgius. Užrašykite objektyvą, kameros konfigūraciją ir kalibravimo duomenis, o pagal juos pridėkite mastelio juostą. Nenustatinėkite juostos pagal vadovėlyje pateiktą vidutinį ląstelės dydį.

Ar buteliuko turinys tinka metodui?

Užrašas „metileno mėlis“ ant buteliuko nėra išsami laboratorinė specifikacija. Patikrinkite koncentraciją ir jos vienetus, tirpiklį, papildomus ingredientus, numatytą paskirtį, partijos dokumentaciją ir instrukcijas. Reagento saugos duomenų lape aprašomi pavojai, o metodo instrukcijose nustatoma, kaip jį naudoti numatytam preparatui ruošti.

Konkretus pavyzdys yra Merck Löffler metileno mėlio tirpalas. Gamintojas jį įvardija kaip mikroskopijos reagentą ir aprašo jo naudojimą kaip kontrastinio dažiklio dažant rūgštims atsparius mikroorganizmus. Nurodytas jo degumas taip pat parodo, kodėl apibūdinimo „mėlynas skystis“ nepakanka planuojant darbą su juo ar kaitinimą. Šios savybės taikomos konkrečios sudėties tirpalui, o ne automatiškai kiekvienam vandeniniam metileno mėlio tirpalui.

Taip pat eozino ir metileno mėlio agaras yra konkrečios sudėties auginimo terpė. Tai nėra preparatų dažiklis, gaunamas tiesiog į mėginį įpylus metileno mėlio. Jei siekiate kitokio vaizdinimo tikslo, palyginkite metileno mėlio alternatyvas mikroskopijoje.

Naudodami pradedantiesiems skirtą mikroskopo rinkinį, pradėkite nuo jo dokumentacijoje pateikto mokomojo metodo, žinomų paruoštų preparatų ir nurodyto reagento. Jei buteliukas nebeturi etiketės arba jo turinio sudėties negalima nustatyti, pakeiskite jį tinkamu dokumentuotu reagentu. Naudokite akių apsaugą ir laikykitės konkrečios sudėties reagentui pateiktų darbo instrukcijų. Dirbant su žmogaus kilmės medžiaga ir nežinomais aplinkos mėginiais, būtina laikytis mokomosios laboratorijos mėginių tvarkymo ir atliekų šalinimo procedūrų; dažymas šių procedūrų neatstoja.

Pirmiausia užrašykite stebėjimą, tada – išvadą

„Mėlyni ovalūs objektai sankaupose“ yra pagrįstas vaizdo aprašymas. Teiginiui apie „konkrečią infekciją“ reikia įrodymų, kurių vaizdas nepateikė. Užrašuose atskirai nurodykite mėginio kilmę, paruošimą, dažymo reakciją ir identifikavimo metodą. Šis atskyrimas suteikia vertės paprastam mokomajam vaizdui ir neleidžia patrauklia mikrofotografija grįsti teiginio, kurio ji negali pagrįsti.