D'Experimenter, déi Methylenblo mat der Zellootmung a Verbindung bruecht hunn

Defibrinéiert mënschlecht Blutt, dat dräi Stonne laang op 37 °C erwiermt gëtt, verbraucht ongeféier zwee Prozent vum Sauerstoff, deen et enthält. Gëtt virun der Inkubatioun eng kleng Quantitéit Methylenblo bäigefüügt, verbraucht dat selwecht Blutt ongeféier fënnefasechzeg Prozent. Un den Zellen huet sech näischt geännert. Nëmmen d'Léisung war anescht.

Dës Zuel staamt aus enger Publikatioun vun 1928 vum George Harrop an E. S. Guzman Barron vu Johns Hopkins. Si ass den Ursprong vun der dacks widderhuelter Ausso, datt Methylenblo d'Zellootmung verbessert. D'Ausso ass net falsch, mee si huet eng méi enk Bedeitung, wéi et kléngt.

Wat d'Zuel an der Tabell tatsächlech moosst

Den Endpunkt war d'Sauerstoffopnam, déi duerch Gasanalyse bestëmmt gouf. Den Harrop an de Barron hunn frësch ofgeholl Blutt bei 10 °C duerch Kottengwatt gefiltert, fir déi wäiss Bluttzellen ze entfernen. Si hunn d'Prouf mat Sauerstoff gesättegt, se opgedeelt, engem Deel Faarfstoff bäigefüügt a béid Deeler no der Inkubatioun analyséiert. D'Zuel vun de Leukozyte louch seelen iwwer ongeféier dausend pro Kubikmillimeter. De Sauerstoffverbrauch gouf als deen Undeel vum urspréngleche Sauerstoffgehalt vun der Prouf uginn, dee verschwonne war.

Si hunn och Kuelendioxid gemooss, mee do huet d'Method Schwieregkeete gemaach. Defibrinéiert Blutt huet an der éischter Stonn vun der Inkubatioun bis zu zwee Millimol Kuelendioxid pro 100 mL fräigesat, aus Grënn, déi näischt mat der ënnersichter Reaktioun ze dinn haten. Dowéinst waren d'respiratoresch Quotiente vum Vollblutt net brauchbar. Nëmme gewäschen Zellen an enger Locke-Léisung hu Wäerter geliwwert, déi sech interpretéiere gelooss hunn. Déi louchen, mat an ouni Faarfstoff, tëscht 0.73 an 0.80.

Dat ass keen onwichtegen Detail. „Ootmung“ bedeit an dëse Publikatioune Gasaustausch an engem zouene Gefäss. Den Ënnerscheed tëscht Sauerstoffverbrauch an nëtzlecher Energieproduktioun gëtt separat am Artikel wat de Sauerstoffverbrauch iwwer ATP verréit a wat net ënnersicht.

De Faarfstoff huet do am meeschte bewierkt, wou d'Zellen am mannsten geotemt hunn

Ausgeräiften Erythrozyte vu Mamendéieren hu bal kee moossbare Sauerstoffverbrauch. Erythrozyte vu Vullen, déi en Zellkär hunn, dogéint schonn. Den Harrop an de Barron hu béid ënnersicht, an de Kontrast ass de Kär vun hirer Argumentatioun.

An de Prouwe vu Mamendéieren huet de Faarfstoff de Verbrauch ëm dat zwanzeg- bis fofzegfacht erhéicht. Am Gänseblutt, deem seng Zelle scho geotemt hunn, huet en den Taux ni méi wéi verduebelt. Wat d'Ootmung am Ufank méi héich war, wat de Faarfstoff manner bäidroe konnt.

Déiselwecht Ofstufung weist sech bannent enger Aart. Eng mënschlech Prouf vun engem Patient mat Polycythaemia vera, déi onräif Zellen enthale huet, huet ouni Faarfstoff 11.3 Prozent vun hirem Sauerstoff verbraucht, géintiwwer 2.8 Prozent bei gewäschen Zelle vun engem gesonden Donateur. De Faarfstoff huet de Verbrauch nëmmen op 63.4 Prozent bruecht: eng sechsfach Beschleunegung, wou normal Zelle bal eng drëssegfach Beschleunegung gewisen hunn. De Faarfstoff huet ausgeräiften Zelle méi no un d'Verhale vun onräifen Zelle bruecht, genee wéi d'Auteuren et beschriwwen hunn.

Cyanid hätt et misse stoppen

Et war bekannt, datt Cyanid d'zellulär Oxidatioun stoppt. Den Harrop an de Barron hunn et trotzdeem zesumme mam Faarfstoff bäigefüügt.

D'Resultater vum Rannerblutt si representativ. Ouni Zousätz ass de Sauerstoffgehalt iwwer dräi Stonne vun 22.61 op 22.03 Volumenprozent gefall. Mat Methylenblo ass en op 12.84 gefall. Mat Methylenblo an enger ee-fënneftausendstel-molarer Kaliumcyanid-Léisung ass en op 12.74 gefall. Den Effekt vum Faarfstoff war am Fong onverännert.

Ofbildung: eng kontinuéierlech Mikrorespirometrie-Opzeechnung vu mënschlechen Erythrozyten. De Feil markéiert d'Zousaz vu Methylenblo. Virdrun ass d'Kéier bal flaach; duerno klëmmt se stänneg. Reproduzéiert aus Harrop a Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Hir Conclusioun war, datt de Faarfstoff als Sauerstoffdréier wierkt, „andeems en eng Substanz liwwert, déi aus den ausgeräiften Erythrozyte vu Mamendéieren ouni Zellkär verschwonnen ass.“ Zwee Joer méi spéit hunn de Michaelis an de Salomon um Rockefeller Institute déi ënnerschiddlech Interpretatiounen an hir dauerhaft Form bruecht. Entweeder war den Effekt vum Faarfstoff „eng zoufälleg Eegenschaft vum Faarfstoff“, oder de Faarfstoff war „e Modell fir eng onbekannt Substanz an den Organismen“. Dës Alternativ ass nach ëmmer net gekläert. Wat sech geännert huet, ass, datt d'Zellen haut vill méi präzis beschriwwe kënne ginn.

E Liewerextrakt huet dat selwecht gemaach

De Michaelis an de Salomon hu gewisen, datt Kaltwaasserextrakter vun Organer déiselwecht Stimulatioun ausléisen. Rateliewer hat de stäerksten Effekt, gefollegt vun Nier, Mëlz an Hoden. Gehier, Muskel a Bluttserum hate wéineg oder keen Effekt.

Duerno hu si den Extrakt mat Kuelemonoxid getest. D'Ootmung, déi entweder vum Extrakt oder vum Faarfstoff ausgeléist gouf, ass an enger Mëschung aus 98 Prozent Kuelemonoxid an 2 Prozent Sauerstoff onverännert bliwwen. Déiselwecht Gasmëschung huet d'Ootmung vun Hief a vu Gefligelerythrozyte mat Zellkär ëm ongeféier 60 bis 80 Prozent gehemmt, am Aklang mat dem Warburg senger Beschreiwung vun engem Ootmungsferment, dat empfindlech op Kuelemonoxid reagéiert. Déi net identifizéiert Gewësssubstanz war also net dem Warburg säin Enzym.

Verschidde méiglech Identitéite goufen am Laf vun den Ënnersichungen ausgeschloss. Reduzéiert Glutathion a Cystein hunn nëmmen dee Sauerstoffverbrauch verursaacht, dee fir hir eegen Oxidatioun néideg war. Dem Harden a Young säi Coenzym gouf ausgeschloss, well de Muskel am meeschten dovun enthält an awer bal dee klengsten Effekt gewisen huet. Dem Keilin säi Cytochrom, dat e puer Joer virdrun benannt gi war, ass op dee selwechte Widdersproch gestouss. Hir eege Vermutung, datt déi aktiv Substanz aus dem Zellkär kënnt, hu si als eng reng Vermutung bezeechent.

Den Effekt war u Bedéngunge gebonnen

D'Zelle missten intakt sinn. Hämolyse duerch destilléiert Waasser oder widderholl Afréieren huet d'Reaktioun souwuel op de Faarfstoff wéi och op den Extrakt opgehuewen. Deelweis Hämolyse huet se entspriechend reduzéiert.

Och Zocker war néideg. Glukos, Fruktos a Saccharos hunn déi duerch de Faarfstoff ausgeléisten Ootmung ënnerstëtzt; Mannitol net. Ouni Zocker gouf et iwwerhaapt keng Ootmung, an de Faarfstoff schéngt d'Zellen dobäi beschiedegt ze hunn. Glukos, déi eng oder zwou Stonne méi spéit bäigefüügt gouf, huet d'Ootmung dofir net erëm hiergestallt. D'Auteuren hunn ugeholl, datt de Faarfstoff e strukturelle Bestanddeel oxidéiert, deen d'Zell brauch.

Liicht huet den Effekt vum Faarfstoff däitlech verstäerkt, obwuel den Effekt och am Däischtere kloer war. Aner reduzéierbar Faarfstoffer hu sech anescht verhalen: Toluylenblo war grad esou staark oder méi staark wéi Methylenblo, wärend Indigodisulfonat bal näischt bewierkt huet. Et huet sech kee kloren Zesummenhang tëscht dem Oxidatiouns-Reduktiounspotenzial vun engem Faarfstoff an der Gréisst vu sengem Effekt gewisen. D'Auteuren hunn dat op d'Membranpermeabilitéit an d'Toxizitéit zeréckgefouert.

Den Effekt ass mat der Fermentatioun gaangen, net mat der Ootmung

Dem Barron seng Etüd vun 1930 ass vun Zellsuspensiounen op Gewëssschnëtter vun normale Ratenorganer an transplantéierten Tumoren iwwergaangen.

A Gewëss ouni aerob Glykolys huet Methylenblo näischt bewierkt oder de Sauerstoffverbrauch liicht reduzéiert: an der Nier ëm ongeféier 14 Prozent, an der Bauchspaicheldrüs ëm ongeféier 14 Prozent, an der Liewer ëm ongeféier 5 Prozent. A Gewëss, dat a Präsenz vu Sauerstoff fermentéiert, huet et de Verbrauch erhéicht: an der Mëlz ëm ongeféier 8 Prozent, am Gehier ëm ongeféier 13 Prozent. Bei Tumore louchen d'Erhéijunge vun ongeféier 27 Prozent bei engem mënschleche Broschtkarzinom bis iwwer 80 Prozent bei engem Rous-Sarkom vum Hong, ongeféier proportional zu der aerober Glykolys vum jeeweilege Gewëss.

Ofbildung: all Punkt steet fir eng Gewëssaart. Déi horizontal Achs weist d'aerob Glykolys; déi vertikal Achs weist d'Verännerung vum Sauerstoffverbrauch nom Zousaz vu Methylenblo. Donnéeën aus Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Tabell 6, PMID 19869777.

D'Cyanidexperiment huet duerno dat ëmgedréint Bild geliwwert. Wéi d'Ootmung an deem Gewëss, dat virdrun net reagéiert hat, mat Cyanid blockéiert gouf an d'Fermentatioun ervirgetrueden ass, huet de Faarfstoff de Sauerstoffverbrauch nees erhéicht: an der Nier ëm ongeféier 59 Prozent, an der Liewer ëm ongeféier 19 Prozent, an der Mëlz ëm ongeféier 286 Prozent, am Hoden ëm ongeféier 200 Prozent.

De Barron huet virgeschloen, datt de Faarfstoff als Test fir d'Fermentatiounskapazitéit vun enger Zell oder engem Gewëss dénge kéint. Zum Schluss huet hie spekuléiert: Generatioune vun Tumorkulturen an engem Medium mat Faarfstoff kéinten enges Daags de Metabolismus vun engem Tumor dauerhaft deem vun normalem Gewëss änlech maachen. Dat war eng Fuerschungsfro, déi 1930 formuléiert gouf. Et ass keng Ausso iwwer eng Behandlung.

Wat d'Experimenter net gemooss kënne hunn

1928 an 1930 huet „Ootmung“ Sauerstoffverbrauch bedeit. Adenosintriphosphat gouf fir d'éischt 1929 beschriwwen. Den Noweis, datt isoléiert Mitochondrie Phosphat veresteren, wärend si Elektronen iwwerdroen, koum 1949. Keng vun de fréie Publikatiounen iwwer Methylenblo konnt d'Energieproduktioun gemooss hunn, a keng huet dat behaapt.

D'Zelle sinn den zweete Problem. Ausgeräiften Erythrozyte vu Mamendéieren enthalen keng Mitochondrien. Wärend dem Retikulozytestadium eliminéiere si Mitochondrien a Ribosomen duerch selektiv Autophagie. Dofir leeft eng ausgeräift rout Bluttzell mat Glykolys an ass haaptsächlech fir NADPH, net fir ATP, op hire Pentosephosphatwee ugewisen. An den Experimenter vun 1928 war keng Elektronentransportkette do, déi hätt kënne reparéiert ginn. Wat och ëmmer de Sauerstoff verbraucht huet, et huet eppes anescht gemaach.

Wat dat war, ass haut zimlech gutt beschriwwen. Methylenblo hëlt Elektrone vun zelluläre Reduktiounsequivalenter op a gëtt zu Leukomethylenblo. Dat gëtt duerch molekulare Sauerstoff nees oxidéiert, wouduerch de Kreeslaf zougeet. A mënschleche roude Bluttzelle féieren NADPH-ofhängeg Flavinreduktase a verwandten Disulfidreduktasen de Reduktiounsschrëtt aus. Eng Etüd vun 1976 mat markéierter Glukos huet festgestallt, datt de Faarfstoff den Hexosemonophosphatwee stimuléiert, datt den Effekt bei niddreger Konzentratioun vun Oxyhämoglobin ofhängeg war an datt eng méi héich Konzentratioun, 0.1 mM, Waasserstoffperoxid produzéiert huet. E reduzéierte Faarfstoff, deen op Sauerstoff trëfft, produzéiert Peroxid, keng Phosphatbindungen.

Bei de Mitochondrien ass d'Bild méi ëmstridden, wéi déi populär Zesummefaassungen zouginn. Eng Fuerschungsrichtung geet dovun aus, datt de Faarfstoff Elektronen aus dem Beräich vum Komplex I ophëlt an un de Cytochrom c weidergëtt. Eng aner huet festgestallt, datt en a Mitochondrien aus dem Gehier vu Mais d'Ootmung no enger Blockad mat Antimycin net erëm hierstelle kann. Si huet den Elektronenakzeptor amplaz un der Ubiquinol-Bindungsplaz vum Komplex III situéiert. Eng drëtt huet festgestallt, datt niddreg Konzentratiounen de Sauerstoffverbrauch am Rouzoustand erhéicht hunn, wärend déi duerch ADP stimuléiert Ootmung onverännert bliwwen ass. Déi direktst Ausso dozou ass, datt de Sauerstoffverbrauch, deen duerch Methylenblo ausgeléist gëtt, iwwerhaapt net vun der oxidativer Phosphoryléierung ofhänkt: e blouf bestoen, wann d'Ootmungskette gehemmt war, an och a Preparater ouni esou eng Kette.

Et gëtt och direkt Miessunge vum Ënnerscheed tëscht deenen zwou Gréissten. An isoléierte Mitochondrien aus Rateliewer hunn ëmmer méi héich Faarfstoffkonzentratiounen d'respiratoresch Kontrollquotiente reduzéiert an eng Schwellung ausgeléist. D'Auteuren hunn dat als Entkopplung vun der oxidativer Phosphoryléierung beschriwwen. An enger perfuséierter Rateliewer huet Methylenblo de Sauerstoffverbrauch erhéicht, wärend den ATP-zu-ADP-Verhältnis gefall ass.

Déi klinesch Befunde vermëttelen dee selwechte Message. Methämoglobinämie gëtt mat ongeféier engem bis zwee Milligramm Methylenblo pro Kilogramm intravenös behandelt, iwwer en NADPH-ofhängege Reduktiounswee. Méi héich Dose verursaachen deen Zoustand, dee behandelt gëtt. Déi selwecht Iwwersiicht hält fest, datt den Effekt als Antidot an intakten Erythrozyten am gréissten ass a bei Hämolyse ofhëlt. Dat ass d'Feststellung iwwer Hämolyse vun 1930, déi dräiasiwwenzeg Joer méi spéit an engem Spidolskontext nees opdaucht. Bei enger Verbindung, där hir nëtzlech a schiedlech Effekter op entgéintgesate Säite vun enger Dosisschwell leien, soll d'Dosis net aus enger Miessung vum Sauerstoffverbrauch ofgeleet ginn.

Firwat d'Charge an d'Diskussioun gehéiert

Den Harrop an de Barron hunn eppes bemierkt, dat et wäert ass, nach eng Kéier gelies ze ginn. Methylenblo selwer produzéiert am Spektroskop eng Band tëscht den zwou charakteristesche Bande vum Methämoglobin, „wat bei enger iwwerflächlecher Betruechtung liicht zu Verwiesslunge féiere kann.“ De Faarfstoff kann d'Substanz imitéieren, déi gesicht gëtt.

Dee selwechte Problem huet eng cheemesch Form. E verwandte Phenothiazin, dat als Niewebestanddeel virkënnt, huet säin eegent Redoxverhalen, seng eege Permeabilitéit a seng eege Toxizitéit. Een dokumentéierte Fall mécht d'Bedeitung konkret: An enger Etüd iwwer d'Iodéierung vu Methylenblo hu Prouwe mat ongeféier 7 bis 8 Prozent Azure B haaptsächlech iodéiert Azure B produzéiert. Also huet d'Veronrengegung, an net d'Methylenblo, d'Reaktioun dominéiert.

Jiddereen, dee Methylenblo als Reagens benotzt, am Laboratoire, op enger Fierfaarbechtsplaz oder an engem Aquarium, schafft mat engem net spezifizéierte Bestanddeel, ausser d'Charge gouf charakteriséiert. Verwandte Substanzen, Identitéit, elementar Veronrengegungen, Reschtléisungsmëttel a Glühréckstand sinn Deel vum Experiment, net nëmme Pabeieraarbecht ronderëm. Blupreme bezitt säi Methylenblo vun engem pharmazeuteschen Hiersteller a publizéiert e komplette Certificat d'analyse. Dobäi gëtt déi ganz USP-Spezifikatioun getest, net nëmmen d'Schwéiermetaller. De Guide fir e Certificat d'analyse ze liesen an den Artikel iwwer wat d'Bezeechnung USP-Qualitéit beleet a wat net erklären, wéi een d'Dokument mat der Ausso ofgläicht.

D'Zuel war richteg

D'Experimenter vun 1928 an 1930 goufe suergfälteg duerchgefouert, an hir zentral Observatioun huet Bestand: E reduzéierbare Faarfstoff kann eng Zell, déi kaum ootemt, dozou bréngen, e Villfacht vun hirem Sauerstoffverbrauch am Rouzoustand ze verbrauchen, ouni duerch dee Schrëtt ze goen, dee vum Cyanid blockéiert gëtt.

De Feeler kënnt eréischt méi spéit, wann „Ootmung“ a senger moderner Bedeitung gelies gëtt. Eng Gasaustauschmiessung weist, datt Elektrone beim Sauerstoff ukomm sinn. Si weist net, datt iergendee vun hinne benotzt gouf, fir ATP ze produzéieren. An enger Zell ouni Mitochondrien kéint den Ënnerscheed tëscht deenen zwou Aussoe kaum méi grouss sinn. Den iwwergräifenden Iwwerbléck iwwer dat, wat Methylenblo an Zelle mécht setzt déi selwecht Ënnerscheedung an e méi breede Kader. D'Geschicht vun der Verbindung, vum Faarfstoff zum Medikament erkläert, wéi en Textilfaarfstoff iwwerhaapt an dësen Experimenter gelant ass.