Метилен көгі және митохондриялар: электрон тасымалы мен дәлелдер

Қатар тұрған екі препаратты елестетіңіз. Екеуінде де тыныс алу тізбегінің I кешенін бөгейтін ротенон химикатымен уланған ми митохондриялары бар. Тәжірибеші олардың біріне пипеткамен метилен көгінің микромолярлық дозасын қосады. Оттегіні пайдалану ішінара қалпына келеді. Мембранадағы электрлік кернеу ішінара қайтады. ATP синтезі аз мөлшерде қайта басталады. Ал жанындағы кюветада пероксид датчигі оқиғаның екінші жағын көрсетеді: сыналған әр дозада және қолданылған әр субстратта сутек пероксидінің түзілуі бірнеше есе артқан.

Екі өлшем де дұрыс. Метилен көгі — тыныс алу тізбегінің зақымданған бөлігін айналып, электрон ағынын сақтай алатын тасымалдаушы; сонымен қатар бұл тасымалдың құны пероксид түзілуінің артуымен төленеді. Осы екі деректі қатар ескерсеңіз, метилен көгінің митохондриялық қызметке әсері туралы әдебиет түсінікті бола бастайды. Біреуін ғана ескерсеңіз, алдымен қай мақаланы ашқаныңызға қарай ол не ғажайып, не қауіп болып көрінеді.

Электрон тасымалдаушысы: қарапайым түсіндірме

Тыныс алу тізбегі — эстафеталық тасымал желісі. Электрондар I кешенге (NADH-тан) немесе II кешенге және соған байланысты флавин ферменттеріне (сукцинаттан және ұқсас донорлардан) түседі, III кешен арқылы жылжымалы тасымалдаушы цитохром c-ге, одан әрі IV кешен арқылы оттегіне өтеді. Әрбір берілу кезінде протондар ішкі мембрана арқылы айдалады, ал пайда болған градиент ATP синтезін іске қосады. Кез келген буынды бөгесеңіз, оның алдындағы тізбек бөлігі тоқтайды.

Метилен көгі осы жүйеге қатарлас тасымалдаушы ретінде қосылады. Оның тотыққан түрі тізбектің алдыңғы бөлігіндегі тасымалдаушылардан электрондарды қабылдап, түссіз тотықсызданған түрге — лейкометилен көгіне айналады. Кейін ол электрондарды тізбектің кейінгі бөлігіне беріп, қайтадан көк түске енеді. Бұл екі түр тотығу-тотықсыздану жұбы туралы мақалада сипатталған, ал тасымалдың жалпы сипаты әсер ету механизмінің жалпы түсіндірмесінде қарастырылады. Ашық қалған сұрақ — тасымалдаушының тізбекке қай жерден қайта қосылатыны: III кешеннің Qo учаскесі деп аталатын хинол байланыстыру қалтасынан ба, әлде тікелей цитохром c арқылы ма? Қай шығу жолының басым болатыны жағдайға байланысты; бұл III кешенді айналып өту талдауында егжей-тегжейлі баяндалған.

Кеміргіштердегі үш зерттеу нақты нені өлшеді?

Үш зерттеудің бәрінде оқшауланған ми митохондриялары, яғни жасушадан бөлініп алынған және құрамы белгілі буферде суспензияланған органеллалар пайдаланылды. Тұтас жасушалар да, препарат берілген жануарлар да, адам қатысушылар да болған жоқ. Концентрациялар адамның ауыз арқылы қабылдайтын дозасына емес, органеллаларды қоршаған ерітіндіге қатысты. Осы шеңберді естен шығармай қарасаңыз, сандардың мағынасы айқын болады.

Теңіз шошқасының оқшауланған ми митохондрияларында 100 наномолярдан 2 микромолярға дейінгі концентрацияларда жүргізілген алғашқы зерттеу бір препаратта пайда мен шығынды қатар бағалады. Сау митохондрияларда бояғыш тыныштық күйдегі оттегіні пайдалануды арттырды, бірақ ADP ынталандырған тыныс алуды өзгертпеді, сондықтан тыныс алумен байланысқан ATP өндірілуі жақсармады. I кешен бөгелгенде, 2 микромолярлық концентрация ATP синтезін минутына әр миллиграмға шаққанда 46-дан 93 наномольге дейін қалпына келтірді; қалыпты жылдамдық шамамен 1109 болды. III кешен бөгелгенде, дәл сол концентрация ATP өндірілуін шамамен 46-дан 63-ке дейін қалпына келтірді; қалыпты жылдамдық шамамен 910 болды. Кернеу мен кальцийді сіңіру ішінара қалпына келді. IV кешеннің цианидпен бөгелуін айналып өту мүмкін болмады, демек электрондардың пайдалы шығу нүктесі жұмыс істеп тұрған IV кешеннің алдында орналасады. Қалпына келудің әрбір нәтижесі статистикалық тұрғыдан сенімді, бірақ шағын болды: қалыпты ATP өндірілуінің бір таңбалы пайыздық үлестері ғана.

Тышқанның ми қыртысы митохондрияларында шамамен 1 микромолярлық концентрацияда жүргізілген екінші зерттеу I кешенді айналып өтуді растады және III кешенде шектеу барын көрсетті. Ротенон тыныс алуды минутына әр миллиграмға шаққанда шамамен 121 наномоль оттегінен 2-ден төмен деңгейге түсірді, ал бояғыш оны шамамен 21-ге, яғни қалыпты деңгейдің алтыдан біріне дейін көтерді; мембрана кернеуі дерлік толық қалпына келді. Бірақ III кешен бөгелгеннен кейін 1-ден 5 микромолярға дейінгі концентрациялардың ешқайсысында тыныс алу да, кернеу де қалпына келмеді, ал бөгелу бояғыш туғызған пероксид сигналын басып тастады. Авторлар тотықсызданған бояғыш өз электрондарын III кешеннің Qo учаскесіне жеткізеді деген болжам ұсынды: бұл учаске бос болмаса, тасымалдаушы электрондарды жеткізе алмайды.

Тышқан, егеуқұйрық және теңіз шошқасының ми митохондрияларында негізінен 2 микромолярлық концентрацияда жүргізілген үшінші зерттеу осы қайшылықты тікелей тексеріп, III кешеннің бөгелуін айналып өтуге болатынын анықтады. Qo учаскесінің тежегіші миксотиазол бастапқы тыныс алуды 88 пайызға азайтқан жағдайда, бояғыш оттегіні пайдалануды бөгелмеген деңгейдің шамамен 62 пайызына дейін қалпына келтірді. Тікелей сынақта жарты микромолярлық концентрация III кешен бөгеліп тұрса да сырттан қосылған цитохром c-ні тотықсыздандырды. Бұл NADH-тан бояғыш арқылы цитохром c-ге, одан әрі IV кешенге өтетін жолды қолдайды. Алайда қалпына келген тыныс алу қалыптан тыс сипат көрсетті: қосылған ADP оттегіні пайдалануды арттырудың орнына төмендетті, ал ATP синтезін бөгеу тыныс алуды ынталандырды. Кернеу тек ішінара қайта полярланды. Байланысу реакциясы кері бағытқа ауысқан кезде оттегінің көп пайдаланылуы қалыпты энергия өндірілуі емес.

Зертханалар неге келіспейді және мәселені не айқындайды?

Айырмашылықты жануар түрімен түсіндіру ең алдымен жарамсыз болып шығады. Үшінші топ жұмысты кеміргіштердің үш түрінде қайталап, бәрінде, соның ішінде айналып өту жоқ деп хабарланған тышқан штаммында да, сапалық тұрғыдан бірдей айналып өтуді анықтады. Айырмашылықтар басқа жерде: концентрацияда (1 және 2 микромоляр), тежегіштердің дозаларында, буферлерде, оқшаулау әдістерінде және ең бастысы, салыстырылған энергетикалық күйде. Айналып өту ADP қосылғанға дейін, дәл сол парадоксты ADP жауабы байқалатын жағдайда ең анық көрінеді. Сондықтан шынайы сызба жағдайға тәуелді екі шығу жолын көрсетеді: бірі Qo учаскесінде, екіншісі цитохром c-де. Тасымалдаушы электрондарды жергілікті химиялық жағдай мүмкіндік беретін жерге жеткізеді.

Пероксид түріндегі құн

Шығын жағы да қалпына келу жағы сияқты тұрақты байқалады. Теңіз шошқасымен жүргізілген жұмыста бояғыш сыналған барлық жағдайда — тыныштық күйде, ATP синтезі кезінде және химиялық зақымдану кезінде — үш субстраттың бәрінде пероксид бөлінуін арттырды. ATP синтезі кезінде 1 микромолярлық концентрацияда оның түзілуі минутына әр миллиграмға шаққанда шамамен 148-ден 1500-ден астам пикомольге дейін өсті, ал тіпті 100 наномолярлық концентрацияда да сигнал төрт еседен артық күшейді. Бояғыш пероксидтің жойылуын да шамамен 2.6 есе баяулатты, сондықтан сигнал түзілуінің жеделдеуін де, шығарылуының баяулауын да көрсетеді. Ұсынылған химиялық түсіндірме — тотықсызданған бояғыштың анықталатын супероксид түзбей, оттегіні тікелей тотықсыздандыруы. Дегенмен бұл әзірге дәлелденген саты емес, нәтижелерді түсіндіру нұсқасы болып қалады.

Тышқандағы жұмыс көріністі пайдалы түрде күрделендіреді. Доза артқан сайын пероксид деңгейі күрт көтеріліп, 2 микромолярлық концентрацияда минутына әр миллиграмға шаққанда шамамен 76 пикомоль бастапқы деңгейден 2000-ға жуық деңгейге жетті. Соған қарамастан, III кешенді бөгеу бояғыш туғызған құрамдасты басып тастады. Егер пероксид тек тотықсызданған бояғыштың оттегімен әрекеттесуінен түзілсе, тізбекті бөгеудің әсері соншалықты үлкен болмауға тиіс еді. Бірақ әсері бар, демек тізбек те қатысады. Антиоксиданттық және прооксиданттық қасиеттерге шолу осы екіжақтылықты кеңірек аяда қарастырады, ал оттегі мен ATP көрсеткіштерін салыстыру талдауы неліктен тек оттегі көрсеткіштері энергия туралы тұжырымды ешқашан дәлелдей алмайтынын түсіндіреді.

Қызметті қалпына келтіру — жөндеу емес

Қолданудан бас тарту керек тіркес — «метилен көгі митохондрияларды жөндей ме?». Жөндеу тұрақты түзетуді білдірер еді: кешендердің қайта құрылуы, препарат кеткеннен кейін де сақталатын байланысу, тұтас жасушалардағы қалпына келу, содан соң тірі ағзадағы қызметтің жақсаруы. Үш мақаланың ешқайсысы мұны көрсетпейді. Олар жасанды химиялық бөгелу кезінде жаңадан оқшауланған органеллаларда электрон ағынының қысқа мерзімді қайта бағытталуын көрсетеді; бұл ретте ATP өндірілуі қалыпты деңгейдің шағын үлестерін ғана құрайды, ал байланысу кейде айқын оғаш сипат алады. Ротенон мен антимицин — зертханалық құралдар, қартаюдың немесе адамның митохондриялық ауруларының модельдері емес. Мұндағы ешбір нәтиже сау адамның энергиясы артады дегенді білдірмейді: бұл адамдарға қатысты өз әдебиеті бар жеке дәлелдер мәселесі.

Үш шектеу биохакингке қатысты кез келген қорытындының адал болуына көмектеседі. Біріншіден, қоршаған ерітіндідегі концентрация доза емес: оқшауланған органеллалар маңындағы 0.1-ден 2 микромолярға дейінгі концентрация адамның ми митохондриясында осындай бос концентрацияны ауыз арқылы қабылданатын қандай мөлшер туғызатынын айтпайды. Оның үстіне бояғыштың жиналуы немесе босап шығуы мембрана кернеуінің өзіне тәуелді. Екіншіден, оттегі энергия емес: бояғыш оттегіні пайдалануды өнімді фосфорлану арқылы ғана емес, циклдік айналым мен электрондардың жанама ағуы арқылы да арттыра алады. Сондықтан ATP пен кернеу көрсеткіштерінсіз жүргізілген респирометрия энергия туралы тұжырым жасауға негіз бола алмайды. Үшіншіден, пайда мен жүктеме бір сөйлемде қатар айтылуы тиіс: қалпына келген кернеу немесе ATP туралы айтқанда, қатар жүретін пероксидтің артуын елемеу тәжірибені бұрмалап жеткізу болады. Қатысты нақтылаулар NAD тотығу-тотықсыздану теңгерімінде, дозаға жауап қисығының пішінінде және талдау әдістері жөніндегі нұсқаулықта берілген.

Бір практикалық ескерту: электрон тасымалдау қасиеті дәл осы молекулаға тән. Azure B сияқты деметилденген туыстас қосылыстар да тотығу-тотықсыздану белсенділігіне ие, бірақ әрекеті өзгеше. Сондықтан ішінара ыдыраған ерітіндімен жасалған тәжірибе өзгермеген бояғышпен жасалған тәжірибемен бірдей емес. Тек металдарды тексерумен шектелмей, толық фармакопеялық сипаттама мен жарияланған партия құжатын талап етудің бір себебі осы. Жарық әсерінен жүретін химиялық реакциялар жарық түсетін қолдану жағдайларына тағы бір ескерту қосады; бұл қызыл жарықпен үйлестіру туралы мақалада қарастырылған.

Осының бәрінен кейін тар ауқымды тұжырым күшінде қалады және оны сақтау маңызды: метилен көгі зақымданған оқшауланған митохондрияларда белгілі жағдайларда электрон тасымалдаушысы бола алады, пероксид түзілуінің артуы есебінен ағынды ішінара сақтайды. Бұдан тыс қалғанның бәрі — энергия, ұзақ өмір сүру, жөндеу — бұл зерттеулер әуел бастан беруге арналмаған дәлелдерді күтеді.