Paul Ehrlich e il blu di metilene: come un colorante ha contribuito alla scoperta di farmaci

Il contributo di Paul Ehrlich alla medicina non fu un farmaco. Fu un ragionamento su come studiarne uno.

Nel 1878 presentò una tesi di dottorato la cui sezione iniziale si intitolava "La concezione chimica della colorazione". La tesi sosteneva che colorare una sezione di tessuto e tingere un pezzo di stoffa seguissero la stessa logica. In entrambi i casi, il colore aderisce per un'affinità chimica tra il colorante e il materiale, non perché il tessuto sia assorbente, grasso o conformato in modo da intrappolare un pigmento. Ehrlich era cresciuto osservando suo cugino, il patologo Karl Weigert, preparare sezioni colorate, e ciò che attirava la sua attenzione non erano le immagini, ma il fatto che il colorante scegliesse dove andare.

L'affermazione sembra modesta. Non lo è. Se un colorante si lega a un tessuto per ragioni chimiche, allora il modo in cui il tessuto si colora ne rivela la chimica. Un vetrino colorato smette di essere un'illustrazione e diventa una misurazione.

Ehrlich sviluppò subito questa idea. Nel 1880 combinò il blu di metilene con la fucsina acida e chiamò la miscela un colorante neutro, un neutralen Farbkörper, che distingueva i diversi tipi di globuli bianchi laddove i singoli coloranti allora in uso non riuscivano a farlo. Due anni dopo presentò un metodo con il violetto di metile per colorare i bacilli della tubercolosi, e Koch adottò la procedura nel proprio lavoro.

La teoria che in seguito diede a queste pratiche un fondamento comune è una questione distinta, e la sua collocazione cronologica viene abitualmente appiattita. La teoria delle catene laterali di Ehrlich, l'idea che una sostanza agisca su una cellula perché le due sono chimicamente compatibili, appartiene agli anni 1890, non agli anni dei coloranti. Il lavoro precedente aveva fornito la convinzione che la precedeva: la selettività è chimica e, pertanto, si può cercarla anziché imbattersi in essa per caso.

L'esperimento che trasformò il colorante in una mappa

Nel 1885 Ehrlich pubblicò una monografia sul fabbisogno di ossigeno dell'organismo, con il sottotitolo di studio analitico mediante coloranti. Il metodo consisteva nell'iniettare coloranti il cui colore dipende dallo stato di ossidazione, per poi confrontare come i diversi organi li riducessero o li mantenessero inalterati. Il colorante veniva usato come uno strumento, così come si usa un termometro: segnalava condizioni interne ai tessuti che non si potevano osservare direttamente. Ehrlich stesso dichiarò che lo scopo era determinare, con l'aiuto di particolari coloranti, il potere riducente degli organi viventi.

Il risultato con il blu di metilene arrivò nel 1886, in un articolo sulla reazione del colorante con la sostanza nervosa vivente, presentato a una società medica nel dicembre precedente. Il blu di metilene veniva introdotto nella circolazione di un animale vivo; si prelevavano poi sottili sezioni di tessuto e le si esponeva all'aria, in modo che il colorante incolore accumulato si ossidasse tornando blu e mostrasse dove si era raccolto. Le cellule e le fibre nervose si coloravano, e lo facevano con una selettività sufficiente perché la tecnica diventasse un metodo standard per visualizzare il tessuto nervoso. Il composto non era più soltanto una materia colorante applicata a una sezione morta su un banco da laboratorio. Era un marcatore che si distribuiva all'interno di un corpo vivo, e quella distribuzione poteva essere letta.

La proprietà alla base di entrambi gli esperimenti merita di essere enunciata chiaramente, perché tutto il resto di questa storia dipende da essa. Il blu di metilene è reversibile. La sua forma ridotta, il leucometilene blu, è incolore e, a contatto con l'ossigeno, torna al catione blu. Una soluzione del colorante con glucosio in un barattolo sigillato è incolore; aprendo il barattolo, diventa blu. Si riporta che Ehrlich abbia dimostrato direttamente questo fenomeno trattando sezioni colorate con cloruro di ferro, oltre che con aria, e osservando il ritorno del colore. Un colorante che cambia colore in funzione dello stato redox dell'ambiente circostante è una sonda per quell'ambiente.

Due proprietà, quindi, si affiancavano. Un colorante poteva distinguere un tessuto da un altro. E un colorante poteva essere acceso e spento da una variazione dello stato di ossidazione.

Letta a ritroso, la seconda proprietà è l'inizio della chemioterapia. Se un composto si lega a un tipo di tessuto e non a un altro, allora lo stesso composto potrebbe raggiungere un tipo di organismo e non un altro. Ehrlich espresse direttamente questa deduzione: se un patogeno poteva essere colorato selettivamente, la colorazione poteva indicare un danno specifico a quel patogeno. Un colorante poteva quindi essere utilizzabile come farmaco, diretto contro un invasore anziché contro il paziente.

La prima prova in un paziente non riguardò la malaria. Nel 1890, insieme allo psichiatra Arthur Leppmann, Ehrlich riferì che il blu di metilene alleviava il dolore in condizioni nevralgiche e reumatiche di muscoli, articolazioni e tendini. I due discussero se il farmaco potesse agire sulle malattie mentali e decisero di non provarlo. Un medico italiano, Pietro Bodoni di Genova, procedette comunque. Il suo articolo del 1899 porta nel titolo l'azione sedativa in varie forme di psicosi: descrisse un effetto calmante in quattordici pazienti agitati e osservò che altri medici genovesi stavano già usando il colorante per lo stesso scopo. La sedazione non è un effetto sulla malattia, e questa distinzione ricorre continuamente in questa storia.

Il lavoro sulla malaria arrivò nel 1891, insieme al patologo Paul Guttmann, all'ospedale Moabit di Berlino. Il blu di metilene fu somministrato a due pazienti, e il resoconto apparve nella Berliner klinische Wochenschrift del 28 settembre 1891. Nel primo caso il paziente assunse 0.5 g del colorante in una sola volta la sera del 29 giugno; l'accesso atteso non si manifestò pienamente e l'unico disturbo registrato in seguito fu una lieve stranguria con urine blu. Gli accessi febbrili scomparvero nei primi giorni e i parassiti non erano più presenti nel sangue al più tardi entro l'ottavo giorno. Gli autori conclusero che le loro aspettative erano state completamente soddisfatte. Due casi non controllati non costituiscono una dimostrazione. Il resoconto più completo sul blu di metilene e la malaria, compresi gli studi moderni, merita una pagina a sé, e la domanda interessante qui è più circoscritta: quanto del ragionamento di Ehrlich abbia retto al confronto con il parassita.

Dove il ragionamento ha retto e dove ha fallito

Del meccanismo è rimasto ben poco, almeno nella forma proposta da Ehrlich. La versione ordinata, in cui un catione triciclico piatto si inserisce tra le coppie di basi del DNA del parassita, non regge nel caso di Plasmodium. Il blu di metilene viene ridotto così facilmente da un globulo rosso infetto che non arriva affatto al parassita sotto forma di catione planare, e il meccanismo di intercalazione che si adatta ai coloranti acridinici non si adatta a questo.

Ciò che le evidenze sostengono è meno lineare. Il blu di metilene inibisce la glutatione reduttasi del parassita a concentrazioni raggiungibili in un paziente. Blocca la conversione dell'eme in emozoina, il pigmento inerte che il parassita forma per evitare di essere avvelenato dalla propria digestione dell'emoglobina, con un'efficacia circa pari a quella della clorochina e molto superiore a quella della chinina. Il suo ciclo redox genera inoltre specie reattive dell'ossigeno in una cellula che già le produce. Quale di questi sia il vero meccanismo, o se contribuiscano tutti, non è ancora stato chiarito.

C'è un'ulteriore complicazione, che dovrebbe orientare la lettura di qualsiasi affermazione storica su questo composto. Il blu di metilene commerciale di quel periodo non era una sostanza unica. I campioni contenevano Azure B, il congenere monodemetilato, e nelle soluzioni più vecchie se ne accumulava una quantità maggiore. Azure B è un colorante metacromatico con bersagli diversi: colora il DNA a doppio filamento di blu intenso e l'RNA di verde. Una miscela di due coloranti con destinazioni diverse, in proporzioni che nessuno registrava, non può sostenere un'affermazione inequivocabile su ciò che faceva il blu di metilene al suo interno.

Il colorante in sé non soppiantò mai la chinina. Il metodo ebbe più successo. Wilhelm Roehl, allievo di Ehrlich, lavorando per il gruppo chimico-farmaceutico IG Farben continuò a promuovere i derivati dei coloranti come farmaci per le malattie tropicali e fornì lo strumento mancante: il canarino, infettato da una malaria aviaria, come modello di screening di routine per i composti candidati. Werner Schulemann modificò poi la catena laterale, e il sale di fenotiazinium risultante guarì l'infezione sperimentale. Continuava comunque a colorare i pazienti di blu.

Il risultato duraturo si rivelò essere non il colorante né il sistema di anelli, ma la catena laterale. L'aggiunta di un gruppo dialchilamminoalchilammino cambiò il comportamento della molecola, e il frammento sopravvisse a ogni successiva riprogettazione. Mantenendo quel gruppo e sostituendo l'anello di fenotiazinium con un'acridina, si ottiene la chinacrina. Sostituendolo con una chinolina, si ottiene la clorochina. Pamachina, primachina e amodiachina, tutte ancora nel repertorio degli antimalarici, contengono lo stesso gruppo. Il composto che fallì come trattamento fornì il frammento che ebbe successo.

Il collegamento con gli antipsicotici passa per l'anello, anziché per il farmaco. Fu la determinazione della struttura del blu di metilene a condurre Heinrich August Bernthsen al nucleo di base della fenotiazina nel 1883, ed era su quella struttura, sostituita in modi diversi, che i chimici di Rhône-Poulenc lavoravano negli anni 1940 alla ricerca di antistaminici. Uno di quei composti fu sintetizzato verso la fine del 1950 e sperimentato dal chirurgo Henri Laborit, che notò come lasciasse i pazienti calmi e indifferenti. Il primo impiego psichiatrico pubblicato, in un paziente con mania, risale al gennaio 1952. Il primo antipsicotico non è tanto un discendente dell'antimalarico di Ehrlich quanto un lontano parente del colorante da cui era partito.

Tre abitudini da conservare da questo episodio

1. "Primo farmaco sintetico usato in medicina" descrive una categoria, e le precisazioni necessarie sono più ampie di quanto la frase lasci intendere. La frase è ormai ricorrente; una rassegna molto citata di Schirmer e colleghi su Neurobiology of Aging definisce il blu di metilene il primissimo farmaco interamente sintetico usato in medicina. L'idrato di cloralio fu introdotto come sedativo sintetico nel 1869, oltre vent'anni prima. Lo stesso articolo del 1891 fornisce parte della risposta, perché i suoi autori nominano gli antipiretici sintetici che avevano già fallito contro la malaria, tra cui chinolina, antipirina e antifebrina. Il composto arsenicale di Ehrlich per la sifilide arrivò ancora più tardi. La versione difendibile dell'affermazione riguarda il metodo, non il primato: il blu di metilene è tra i primi composti sintetici scelti per agire contro un organismo specifico sulla base di una teoria chimica della selettività.
2. Una distribuzione selettiva non equivale a un beneficio selettivo. Il risultato di Ehrlich del 1886 era che il colorante raggiunge il tessuto nervoso. Dove va un composto e cosa fa una volta arrivato sono due misurazioni diverse, e la prima è molto più facile da effettuare. È in questo divario che da allora si colloca la maggior parte delle affermazioni sul blu di metilene e il cervello.
3. La purezza appartiene alle evidenze, non al marketing. La documentazione storica è ambigua proprio per questo motivo. Piccole differenze strutturali cambiano la destinazione di questo composto, ed è per questo che un certificato di analisi deve essere collegato a un lotto specifico, anziché presentato come semplice dichiarazione che un prodotto viene testato. Un venditore che dichiara la conformità alla monografia farmacopeica pur analizzando soltanto i metalli pesanti afferma più di quanto il rapporto sostenga. Blupreme si rifornisce di blu di metilene presso un produttore farmaceutico e verifica l'intera specifica prevista dalla monografia: identità, purezza, impurità organiche, solventi residui, impurità elementali, residuo alla calcinazione, limiti microbici ed endotossine batteriche. Il rapporto viene pubblicato insieme al prodotto, e la pagina sul blu di metilene di grado USP spiega quei limiti e perché il risultato relativo ad Azure B è il primo da cercare.

Un percorso cronologico tra le fonti

La sequenza cronologica delle tappe fondamentali, compresa la chimica dei coloranti che precedette Ehrlich e i gradi e le specifiche che vennero dopo di lui, è presentata separatamente nella storia del blu di metilene, mentre l'identità del composto è trattata in che cos'è il blu di metilene.

Le tavole alla base di questo resoconto, riprodotte nella rassegna del 2012 di Krafts, Hempelmann e Skórska-Stania, non sono equivalenti, e un esempio ne mostra il motivo. La tavola del 1891 è la documentazione primaria della sperimentazione; il ritratto del 1910 accanto a essa documenta una reputazione a quella data e nient'altro. Le pagine del taccuino di Andersag del 1934 sono la traccia diretta della sostituzione con la chinolina, scritta di pugno dal chimico.

La sintesi onesta degli esperimenti di Ehrlich con i coloranti è che individuò la selettività e il bersaglio, ma sbagliò il meccanismo. Il blu di metilene si concentra effettivamente nel tessuto nervoso e danneggia effettivamente il parassita della malaria. Non fa la seconda cosa a causa della prima, e la spiegazione chimica che Ehrlich propose per entrambe era sbagliata. Ciò che dimostrò al di là di ogni dubbio fu più duraturo di un meccanismo corretto: un composto può essere scelto anziché trovato, e scelto sulla base di evidenze raccolte prima che qualcuno lo somministri a un paziente.