Blu di metilene, tau e amiloide: perché i meccanismi di eliminazione delle proteine differiscono

Chiedete che cosa faccia il blu di metilene alle proteine della malattia di Alzheimer e sentirete una risposta sicura dove dovreste sentirne tre, ciascuna con le dovute precisazioni. In provetta interferisce con l'aggregazione di tau con se stessa. In un modello murino riduce l'amiloide solubile senza modificare tau. In un altro riduce l'attività dell'enzima che produce l'amiloide a monte. Tutti questi risultati sono reali. Nessuno racconta l'intera storia, e non si verificano tutti nello stesso animale nello stesso momento. Questo articolo li distingue, affinché il risultato di un esperimento non venga più citato come prova di un altro.

Chi desidera un quadro più ampio di come agisce il blu di metilene all'interno delle cellule dovrebbe partire da lì. Chi vuole sapere se tutto questo abbia aiutato i pazienti dovrebbe leggere il quadro delle evidenze cliniche nella malattia di Alzheimer, dove trovano posto gli esiti delle sperimentazioni sull'uomo. Questo articolo non ripete quelle evidenze.

Il risultato su tau riguarda i saggi di aggregazione

La più antica delle tre linee di ricerca deriva da studi in sistemi acellulari su tau, la proteina che forma i grovigli neurofibrillari. Nel saggio di legame tau-tau, frammenti di tau si assemblano in filamenti elicoidali appaiati, e i coloranti fenotiazinici, incluso il blu di metilene, bloccano questo assemblaggio a basse concentrazioni micromolari. Studi biochimici successivi hanno fornito una spiegazione chimica: il colorante ossida i residui di cisteina di tau, stabilizzandone la forma monomerica e impedendo la formazione delle fibrille che altrimenti crescerebbero. Le concentrazioni inibitorie riportate per l'aggregazione di tau si collocano approssimativamente tra poche unità e poche decine di micromolare, un intervallo importante per tutto ciò che segue.

È importante capire di quale tipo di affermazione si tratti. Non dice nulla sulla produzione di tau, sulla sua fosforilazione in un cervello vivente o sulla sua eliminazione. Dice che, in condizioni definite in provetta, il colorante ossidato impedisce a tau di impilarsi. È un risultato preciso, circoscritto e utile. I problemi iniziano quando lo si estende all'affermazione generale secondo cui il blu di metilene elimina la patologia legata a tau, perché i dati sugli animali non sostengono questa versione.

Il risultato sul proteasoma riguarda i topi 3xTg-AD e distingue l'amiloide da tau

L'esperimento che mostra più chiaramente la divergenza tra gli esiti è uno studio alimentare di 16 settimane su topi portatori di tre mutazioni associate all'Alzheimer. Gli animali hanno ricevuto mangime contenente blu di metilene a partire dai sei mesi di età, e i ricercatori hanno misurato contemporaneamente tre aspetti: il proteasoma, i livelli di amiloide e tau.

Il proteasoma ha mostrato cambiamenti. L'attività di tipo chimotripsinico è aumentata di circa un quarto e quella di tipo tripsinico di circa la metà, mentre la terza attività catalitica non è cambiata in modo significativo. L'amiloide-beta solubile 40 e 42 è diminuita, in entrambi i casi, di circa un quarto. Gli autori hanno interpretato questo risultato come un aumento dell'eliminazione anziché una riduzione della produzione, perché la proteina precursore e i frammenti derivati dalla sua elaborazione non sono cambiati; inoltre, apprendimento e memoria sono migliorati nella prova di ritenzione del labirinto acquatico.

Poi emergono le divergenze. L'amiloide insolubile non è cambiata. La colorazione delle placche non è cambiata. La tau umana totale e la tau fosforilata sulla treonina 181 non sono cambiate, né è cambiata la localizzazione anomala di tau. Anche le misure mitocondriali sono rimaste invariate: nessun effetto significativo sull'attività della citocromo-c ossidasi, sulla proteina ossidasi o sull'ATP. Quindi, in questo modello e con questo regime di somministrazione, il blu di metilene ha aumentato due delle tre attività del proteasoma, ridotto l'amiloide solubile e ripristinato una misura comportamentale, lasciando invariati gli esiti relativi a tau, l'amiloide insolubile e gli esiti mitocondriali esaminati.

Una precisazione rafforza il punto anziché indebolirlo. Questi topi non avevano ancora sviluppato aggregati di tau all'età studiata, quindi l'esperimento non può dimostrare che il blu di metilene sia inefficace contro i grovigli di tau. Dimostra che l'amiloide solubile può diminuire mentre gli esiti misurati per tau restano invariati: proprio il tipo di risultato in cui una proteina cambia e un'altra no di cui questo argomento ha bisogno. Se pensavate che l'attivazione del proteasoma da parte del blu di metilene eliminasse insieme entrambe le proteine caratteristiche della malattia, questo studio corregge tale idea.

Il risultato sulla produzione di amiloide riguarda i topi PSAPP anziani e contraddice il meccanismo precedente

Un gruppo diverso, un modello diverso e una spiegazione opposta a monte. In uno studio di tre mesi con somministrazione mediante sonda gastrica su topi PSAPP di 15 mesi, una dose orale giornaliera di 3 mg/kg ha ridotto il carico di placche nelle diverse regioni cerebrali di circa un terzo fino alla metà e ha diminuito diverse frazioni di amiloide, inclusi gli oligomeri misurati con un saggio dedicato. Qui, però, il meccanismo proposto era una riduzione della produzione, non un'eliminazione più rapida: la proteina BACE1 nel cervello è diminuita, il suo prodotto C99 è diminuito, mentre l'RNA messaggero no, suggerendo un effetto a livello proteico anziché una minore espressione genica.

Gli studi cellulari hanno rafforzato questa interpretazione. In un saggio acellulare con enzima ricombinante, il blu di metilene ha inibito direttamente BACE1; nelle cellule ovariche di criceto che esprimevano la proteina precursore dell'amiloide umana, l'amiloide 40 e 42 secreta è diminuita a concentrazioni di appena 1.56 micromolare, mentre il precursore stesso è rimasto invariato. Il confronto con lo studio precedente è netto: lì i frammenti derivati dall'elaborazione del precursore erano invariati e il risultato veniva attribuito all'eliminazione. I due studi non possono descrivere lo stesso meccanismo universale, perché differiscono per modelli, età, dosi, vie di somministrazione e durata. È proprio questo il punto. Gli effetti del blu di metilene sull'amiloide passano attraverso la produzione in un contesto sperimentale e attraverso l'eliminazione in un altro; citare uno dei due senza il relativo contesto è fuorviante.

Una chimica, diversi bersagli: il collegamento attraverso l'ossidazione della cisteina

Una terza linea di ricerca spiega come una stessa chimica redox possa comparire in vicende riguardanti proteine non correlate. In uno studio biochimico sull'inibizione delle caspasi, il blu di metilene ha inattivato la caspasi-6 ossidandone la cisteina catalitica ad acido sulfenico, come confermato dalla spettrometria di massa, con una concentrazione per l'effetto semimassimale vicina a 10.6 micromolare. La caspasi-3 è stata inibita a una concentrazione simile. Gli autori hanno collegato esplicitamente questo risultato alla letteratura su tau: la stessa chimica di ossidazione della cisteina proposta per mantenere tau in forma monomerica può disattivare una proteasi a cisteina, e le concentrazioni efficaci si sovrappongono.

È una spiegazione elegante, ma anche un monito. Una molecola attiva sul piano redox che ossida le cisteine esposte avrà più di un bersaglio a qualsiasi concentrazione attiva. La disaggregazione di tau, l'inibizione delle caspasi e forse altri fenomeni condividono un verbo chimico, ma con soggetti diversi. Quel verbo comune non rende i risultati intercambiabili. Significa che dose e contesto determinano quale bersaglio sia rilevante e che una somministrazione cronica mirata a un processo dipendente dalla cisteina potrebbe influenzarne altri: una considerazione sollevata direttamente dagli autori dello studio sulle caspasi. Le domande correlate su come la chimica redox del blu di metilene selezioni i propri bersagli, su cosa implichi l'attivazione del proteasoma per altre proteine aggregate e su se la somministrazione a lungo termine modifichi il profilo dei bersagli meritano ciascuna un approfondimento specifico.

Meccanismo per esito: quale risultato appartiene a quale modello

Leggendo la tabella riga per riga, la lezione è chiara. Nessuna singola riga mostra cambiamenti in tutte le colonne. Il risultato più solido sulla produzione di amiloide proviene dallo studio che non ha mai esaminato il proteasoma. Il risultato più solido sul proteasoma proviene dallo studio in cui l'elaborazione del precursore non è mai cambiata. Il risultato su tau riguarda soprattutto esperimenti in provetta e una chimica condivisa con enzimi diversi dal bersaglio previsto. Chi riunisce queste colonne in un'unica affermazione, secondo cui il blu di metilene elimina le proteine patologiche come classe, sta scrivendo una rassegna di un esperimento mai eseguito.

Questo rigore si estende ai pazienti. Stabilire se questi meccanismi si traducano complessivamente in un beneficio clinico è una questione distinta, con le proprie sperimentazioni e le proprie conclusioni, e trova risposta nelle evidenze cliniche sull'Alzheimer anziché qui.