Solubilità del blu di metilene e preparazione delle soluzioni: una guida di laboratorio

Due tecnici preparano ciascuno una soluzione di blu di metilene all'1 percento a partire dalla polvere. Uno pesa 1.00 grammo e porta il matraccio a 100 mL. L'altro pesa 1.00 grammo, lo aggiunge a 100 mL di acqua e considera conclusa la preparazione. Un terzo tecnico pesa 1.00 grammo di un lotto diverso e ottiene una concentrazione misurabilmente diversa. Tutti e tre i flaconi sono etichettati allo stesso modo. Nessuno contiene esattamente ciò che indica l'etichetta, e le differenze derivano da tre concetti facili da confondere: quanto soluto può contenere il solvente, che cosa sia effettivamente la polvere pesata e a che cosa si riferisca la percentuale.

Questa guida riguarda esclusivamente la formulazione in laboratorio: coloranti, indicatori, soluzioni madri analitiche e diluizioni di lavoro. Non è una ricetta per medicinali orali o iniettabili, e le concentrazioni riportate non devono essere interpretate come dosi.

Che cosa determina la solubilità e che cosa non determina

La solubilità del blu di metilene in acqua è elevata per un colorante. La scheda del blu di metilene su PubChem riporta circa 43.6 grammi per litro a 25 C, equivalenti a 4.36 grammi per 100 mL, ovvero al 4.36 percento w/v. Uno studio indipendente di equilibratura alla stessa temperatura ha misurato 43.21 g/L, confermando il valore precedente entro l'errore sperimentale.

Questo numero è un limite massimo, non un obiettivo. Una soluzione madre all'1 percento contiene 10 g/L, meno di un quarto del limite massimo. Una soluzione madre allo 0.1 percento contiene 1 g/L, circa un quarantesimo di tale limite. Se una preparazione all'1 percento lascia solidi persistenti dopo un'adeguata miscelazione a temperatura ambiente, il problema non è quasi mai il limite di solubilità. Di solito si tratta di bagnatura incompleta, acqua fredda, grumi di polvere che richiedono più tempo o un soluto identificato erroneamente. Acqua tiepida e agitazione risolvono la maggior parte di questi problemi. Se è stato applicato calore, lasciare che il matraccio torni alla sua temperatura di taratura prima di portarlo al volume finale.

La solubilità in altri solventi è inferiore e meno concordante tra le fonti, in parte perché varia lo stato di idratazione del materiale esaminato. L'acqua rimane il solvente di riferimento per le soluzioni madri di uso ordinario in laboratorio. L'etanolo dissolve il colorante, ma ne può contenere molto meno dell'acqua; anche il cloroformio lo dissolve, la piridina solo leggermente e l'etere dietilico praticamente per nulla. Nelle serie di misurazioni, acetone e acetato di etile presentano valori molto inferiori a quelli dell'acqua. Per il lavoro in ambiente non acquoso, considerare qualsiasi valore di manuale come una stima iniziale da verificare sul lotto effettivo, non come un limite di formulazione. Il punto pratico è semplice: se l'obiettivo è una concentrazione acquosa definita pari o inferiore all'1 percento, l'acqua offre un ampio margine.

La polvere non è sempre la stessa

La polvere di blu di metilene venduta per uso di laboratorio è un sale cloruro che contiene acqua nel reticolo cristallino, e la quantità di quest'acqua varia. Lo ione anidro ha un peso molecolare di 319.85 g/mol. Il triidrato comunemente citato ha un peso molecolare di 373.90 g/mol e il pentaidrato di 409.93 g/mol, valori tabulati nei dati della monografia USP riassunti insieme alla scheda PubChem.

I flaconi commerciali sono spesso etichettati come triidrato, CAS 7220-79-3, ma studi sullo stato solido hanno rilevato che il materiale effettivo può essere un pentaidrato, un idrato parziale con circa 2.2 molecole d'acqua, un diidrato o un monoidrato; in alcune analisi non è stata rilevata alcuna fase cristallina distinta di triidrato. Il colorante è anche igroscopico, quindi il contenuto d'acqua di un flacone aperto cambia nel tempo. Per le colorazioni qualitative questo conta ben poco. Per il lavoro analitico quantitativo conta moltissimo: per questo la guida alla lettura del titolo e del contenuto d'acqua in un certificato di analisi considera il documento del lotto più autorevole della dicitura triidrato sull'etichetta frontale.

Ne derivano due modalità di correzione, da usare una alla volta. Se il certificato riporta il titolo e il contenuto d'acqua o la perdita all'essiccamento, utilizzare direttamente quei valori. Se non sono disponibili dati del certificato e la concentrazione deve essere espressa come equivalente anidro, applicare il fattore teorico dell'idrato: 373.90 diviso 319.85, ovvero 1.169, per il triidrato nominale, e 409.93 diviso 319.85, ovvero 1.282, per il pentaidrato nominale. Non applicare entrambe le correzioni contemporaneamente. In questo modo si conterebbe l'acqua due volte.

Che cosa significa la percentuale

La percentuale w/v indica i grammi del soluto specificato per 100 mL di soluzione finale, non per 100 mL di acqua iniziale. Quindi l'1 percento w/v corrisponde a 1.000 g per 100 mL finali, pari a 10 mg/mL o 10 g/L. Una soluzione allo 0.1 percento contiene 0.100 g per 100 mL finali, pari a 1 mg/mL. La frequente confusione tra 1 percento e 1 mg/mL è un errore di un fattore dieci, ed è opportuno controllare ogni etichetta per escluderlo.

La seconda parte della definizione è la specificazione del soluto. Una soluzione all'1 percento di polvere di triidrato così come pesata e una soluzione all'1 percento espressa come equivalente anidro sono soluzioni diverse. Gli esempi svolti qui sotto indicano ogni volta sia il volume finale sia la base di espressione della concentrazione: è questa abitudine che evita il problema dei tre tecnici descritto sopra.

Esempi di preparazione con ipotesi sull'idrato esplicitate

Tutti gli esempi presuppongono polvere pura dell'idrato indicato e acqua come solvente a temperatura ambiente. Per altri volumi, variare le quantità in modo lineare.

Esempio A: 100.0 mL all'1 percento w/v, riferito al triidrato così come pesato. Pesare 1.000 g di blu di metilene triidrato. Aggiungere circa 70 mL di acqua purificata, agitare con un agitatore o con movimenti circolari fino alla completa dissoluzione, trasferire quantitativamente in un matraccio tarato da 100.0 mL effettuando i risciacqui, quindi aggiungere acqua fino alla tacca. Il soluto è il triidrato stesso, quindi non si applica alcuna correzione del peso molecolare. Risultato: 1.000 g per 100.0 mL finali, ovvero 10 mg/mL di polvere così come pesata.

Esempio B: 100.0 mL a 1 mg/mL, espressi come equivalente anidro, a partire da triidrato nominale. L'obiettivo è ottenere 100.0 mg di blu di metilene anidro in 100.0 mL finali. Moltiplicare per 1.169 per correggere la presenza delle tre molecole d'acqua: 100.0 mg per 1.169 è uguale a 116.9 mg. Pesare 116.9 mg di triidrato nominale, dissolvere in circa 70 mL di acqua e portare a 100.0 mL finali in un matraccio tarato. Per il pentaidrato nominale il fattore è 1.282, quindi lo stesso obiettivo richiede 128.2 mg. Annotare sull'etichetta quale fattore è stato utilizzato.

Esempio C: diluizione del blu di metilene da una soluzione madre all'1 percento allo 0.1 percento. Utilizzare C1V1 uguale a C2V2. Per preparare 100.0 mL allo 0.1 percento da una soluzione madre all'1.0 percento, il volume necessario di soluzione madre è 0.1 per 100.0 diviso 1.0, ovvero 10.0 mL. Pipettare 10.0 mL della soluzione madre all'1 percento in un matraccio da 100.0 mL e aggiungere acqua fino alla tacca. Per gli analisti che preferiscono le unità di massa: l'1 percento corrisponde a 10 mg/mL, quindi 10.0 mL contengono 100 mg, e 100 mg in 100.0 mL finali corrispondono a 1 mg/mL, ovvero allo 0.1 percento.

Esempio D: 1.000 L di soluzione di lavoro a 10 mg/L da una soluzione madre a 1 mg/mL. Una soluzione madre a 1 mg/mL corrisponde a 1000 mg/L. Il volume necessario è 10 per 1.000 diviso 1000, ovvero 0.0100 L, pari a 10.0 mL. Pipettare 10.0 mL di soluzione madre e diluire con acqua fino a 1.000 L finale. Da una soluzione madre all'1 percento, pari a 10,000 mg/L, lo stesso obiettivo richiede soltanto 1.00 mL portato a 1.000 L. Una diluizione seriale in due passaggi offre una precisione migliore rispetto a un singolo trasferimento nell'ordine dei microlitri quando il rapporto supera circa cento.

Ciascuna di queste preparazioni è definita completamente solo perché contiene tre informazioni: la massa pesata con l'ipotesi relativa all'idrato, il volume finale della soluzione e la base di espressione della concentrazione dichiarata. Un'annotazione nel quaderno di laboratorio priva anche di una sola di queste tre informazioni non può essere riprodotta esattamente.

Procedura per evitare gli errori più comuni

Dissolvere prima la polvere in un volume inferiore a quello finale, quindi portare a volume. Aggiungere la polvere direttamente all'intero volume finale di acqua produce una soluzione il cui volume totale supera la tacca prevista, e la concentrazione risulta inferiore. Risciacquare il becher trasferendo i risciacqui nel matraccio, in modo che non rimanga alcuna traccia di colore; il colore intenso rende visibili le piccole perdite, un vantaggio se incoraggia il trasferimento quantitativo.

Miscelare fino a quando non rimangono particelle prima di portare a volume, e controllare in controluce. Filtrare solo quando il metodo lo richiede. Il blu di metilene si adsorbe su alcuni materiali delle membrane, quindi la filtrazione può ridurre la concentrazione di una soluzione madre appena standardizzata: un fenomeno documentato negli studi sull'adsorbimento su membrane, da ricordare quando la filtrazione o la verifica della concentrazione fanno parte del metodo. Se una soluzione madre filtrata deve avere una concentrazione certificata, verificarla dopo la filtrazione, non prima.

Conservare le soluzioni preparate al riparo dalla luce intensa, in flaconi ambrati o opachi a temperatura ambiente, ed etichettarle indicando soluto, riferimento all'idrato, concentrazione, solvente, data e preparatore. Lo sbiadimento fotochimico sotto illuminazione prolungata è una via di degradazione nota, quindi davanzali e frigoriferi illuminati non sono luoghi adatti alla conservazione, anche se il colorante sembra stabile. Le aspettative di stabilità e gli intervalli di ricontrollo sono trattati nella guida alla conservazione e alla stabilità delle soluzioni preparate, ma come regola operativa le soluzioni madri analitiche richiedono una nuova preparazione o una nuova verifica, anziché essere considerate affidabili a tempo indeterminato.

Manipolare la polvere e le soluzioni madri concentrate usando guanti, protezione per gli occhi, camice da laboratorio e una copertura per il banco, con contenimento secondario per i flaconi. Il colorante macchia rapidamente pelle, indumenti, banchi e materiali plastici, e le schede di dati di sicurezza dei fornitori classificano la polvere come nociva se ingerita e irritante per occhi e pelle, a seconda del grado. Le precauzioni complete sono trattate nelle pratiche di manipolazione e conservazione sicure, ma il controllo delle macchie è di per sé una misura di qualità: il colorante fuori posto su vetreria e pipette è una fonte di contaminazione incrociata per le analisi in tracce.

Una nota sul grado

Per bagni di colorazione e dimostrazioni, qualsiasi grado da laboratorio pulito preparato alla concentrazione corretta è adeguato. Per il lavoro quantitativo o comparativo, il grado conta perché le impurità variano: residui di Azure B e tiazine correlate, metalli pesanti, solventi residui e carica microbica. Per questo la scelta di un grado corredato da un certificato di analisi completo fa parte della formulazione, anziché essere una considerazione successiva. Un documento completo del lotto riporta identità, titolo con la relativa base di espressione, contenuto d'acqua e insieme delle impurità effettivamente analizzate, così che la correzione per l'idrato negli esempi precedenti utilizzi valori misurati invece dell'ipotesi di triidrato nominale. Quando due lotti danno concentrazioni diverse a parità di massa pesata, il certificato di solito ne spiega il motivo.