Blu di metilene e sclerosi multipla: che cosa ha esaminato la ricerca sugli animali

Cercando il blu di metilene per la SM si trovano articoli che sembrano rispondere alla stessa domanda. Non è così. Uno studio ha somministrato blu di metilene a topi malati come trattamento. L'altro non ha trattato alcun animale con questa sostanza. Ha usato il blu di metilene come colorante blu su sottili sezioni di midollo spinale, per consentire a un patologo di osservare la mielina al microscopio.

È questo il concetto alla base dell'intero articolo. Il colorante ha due ruoli in biologia, che non condividono nulla tranne il flacone. Come candidato farmaco, viene somministrato a un animale vivo e la domanda è se la malattia cambi. Come colorante, viene applicato a tessuto morto e fissato dopo l'esperimento, e la domanda è quale aspetto avesse il tessuto. Se si perde questa distinzione, si rischia di leggere una sezione sui metodi di analisi patologica come se riportasse un risultato terapeutico.

Che cos'è l'EAE, in parole semplici

L'encefalomielite autoimmune sperimentale, solitamente abbreviata in EAE, è il modello animale standard per studiare alcuni aspetti della sclerosi multipla. Un ricercatore immunizza un topo suscettibile con un frammento di una proteina della mielina insieme a un potente adiuvante. Il sistema immunitario attacca quindi il sistema nervoso centrale dell'animale stesso. Il topo sviluppa una debolezza ascendente, facile da valutare su una scala da 0 a 5, dalla coda flaccida alla paralisi degli arti posteriori.

Questa facilità di attribuzione del punteggio spiega perché l'EAE sia molto usata, ma anche perché possa trarre in inganno. La SM umana insorge spontaneamente, coinvolge una gamma più ampia e meno definita di bersagli e produce sintomi visivi, sensitivi, cognitivi, cerebellari e motori, con un decorso recidivante o progressivo. L'EAE riproduce alcuni meccanismi selezionati, come infiammazione, demielinizzazione e danno assonale, in condizioni controllate. Non riproduce la SM in miniatura. Chi desidera un quadro generale può approfondire come si ritiene che il blu di metilene agisca a livello cellulare prima di valutare una singola affermazione relativa a una malattia.

I due studi descritti di seguito hanno inoltre usato antigeni diversi per indurre l'EAE, e questo conta. Lo studio terapeutico ha indotto la malattia con MOG35-55, un breve peptide della glicoproteina mielinica degli oligodendrociti. Lo studio patologico ha indotto la malattia con MP4, una fusione di segmenti della proteina basica della mielina e della proteina proteolipidica. La scelta del ceppo e dell'antigene modifica la sede delle lesioni e il comportamento dell'infiammazione: i due studi, quindi, non sono due ripetizioni dello stesso esperimento.

La mappa: dal modello alla domanda, fino ai limiti

Tenete questa tabella a portata di mano. È lo schema di riferimento originale di questo articolo. Ogni riga indica a quale domanda clinica il modello può rispondere, che cosa è stato effettivamente misurato e dove si ferma la trasferibilità all'uomo.

Chiunque voglia verificare il prossimo titolo di notizia può riutilizzare le stesse colonne con l'aiuto della guida su come leggere gli studi preclinici: chiedersi quali siano la specie e l'antigene, il ruolo del composto, gli esiti misurati e se il risultato descriva il decorso della malattia oppure un'istantanea del tessuto.

Il risultato terapeutico: che cosa ha modificato la somministrazione

Lo studio terapeutico del 2016 pubblicato sul Journal of Neuroimmunology ha usato topi femmina C57BL/6 di circa 8–10 settimane, immunizzati con 250 microgrammi di MOG35-55 per topo. Dopo l'induzione, gli animali con EAE sono stati assegnati casualmente a un gruppo trattato con blu di metilene o a un gruppo con EAE non trattato, e i punteggi clinici sono stati monitorati fino a circa il giorno 30.

I punteggi clinici erano significativamente inferiori nei topi trattati rispetto ai controlli con EAE dal giorno 15 al giorno 30, con P inferiore a 0.01. L'analisi del midollo spinale indicava la stessa direzione, con minore infiltrazione infiammatoria, minore demielinizzazione e minore perdita assonale negli animali trattati.

L'aspetto distintivo era l'insieme delle analisi della segnalazione. Il trattamento ha aumentato l'attivazione di AMPK e l'espressione di SIRT1 e ha soppresso l'attivazione di NF-kB, un interruttore centrale dell'infiammazione. Sul versante dell'immunità adattativa, ha ridotto la risposta Th17 e rafforzato la risposta Treg. La sequenza proposta è quindi: blu di metilene, poi AMPK e SIRT1, poi riduzione della segnalazione di NF-kB, quindi spostamento dai Th17 infiammatori verso i Treg regolatori, seguito da minore danno tissutale e punteggi più bassi.

Questa sequenza è un'interpretazione, non una catena causale dimostrata. Lo studio mostra che il farmaco, i cambiamenti della segnalazione e il miglioramento della malattia procedono insieme. Non dimostra che AMPK e SIRT1 medino l'intero beneficio, e il testo pubblicamente indicizzato non riporta con sufficiente chiarezza la dose esatta in milligrammi per chilogrammo, la via di somministrazione, il giorno di inizio o la durata per riprodurre il regime dal solo abstract. Qualsiasi valore di dosaggio attribuito a questo studio su una pagina commerciale va considerato non verificato, a meno che non citi i metodi del testo integrale. Il quadro più ampio delle evidenze sull'uomo relative al blu di metilene è il riferimento da consultare per verificare se questo primo segnale immunitario abbia mai portato a dati clinici.

Il risultato patologico: che cosa hanno mostrato sei mesi di osservazione dei tessuti

Lo studio MP4 del 2015 pubblicato su PLoS ONE ha usato topi femmina C57BL/6 immunizzati con 200 microgrammi di MP4 in adiuvante completo di Freund, insieme a tossina della pertosse il giorno dell'immunizzazione e di nuovo 48 ore dopo. Nessun animale ha ricevuto blu di metilene come farmaco. Dopo la fissazione e l'inclusione, sezioni trasversali di midollo spinale spesse un micrometro sono state colorate con blu di metilene per la microscopia ottica; per osservare dettagli più fini è stata usata la microscopia elettronica del tratto ventrolaterale.

I tessuti sono stati campionati in tre fasi: al picco acuto con 7 topi, tre mesi dopo l'esordio con 5 topi e sei mesi dopo l'esordio con 10 topi. I punteggi clinici medi in queste fasi apparivano quasi identici, intorno a 1.7–1.8 sulla scala da 0 a 5. I tessuti raccontavano una storia diversa. Il danno isolato alla mielina è aumentato da circa 569,000 fibre per millimetro quadrato al picco acuto a circa 1,496,000 a sei mesi, con una differenza significativa tra la fase acuta e quella a lungo termine, con P pari a 0.027. Il danno combinato alla mielina e agli assoni è all'incirca raddoppiato entro sei mesi. Le fibre in rimielinizzazione sono rimaste al di sotto dell'uno per cento in ogni fase, un dettaglio che invita alla cautela rispetto alle speranze di riparazione.

Il danno assonale ha seguito un andamento a U: elevato al picco acuto, più basso a tre mesi e massimo a sei mesi. Era inoltre correlato al rigonfiamento mitocondriale e alla riduzione della distanza tra i neurofilamenti. La valutazione è stata eseguita in cieco rispetto al punteggio e alla fase, rafforzando l'interpretazione secondo cui i punteggi clinici sottostimavano il danno strutturale in corso.

Questa discrepanza è il vero contributo dello studio per chi si interessa alla SM. Un punteggio di disabilità stabile non significava che i tessuti fossero stabili. Mostra anche perché questo articolo non possa sostenere alcuna affermazione terapeutica sul blu di metilene e la SM. Ha esaminato il trascorrere del tempo, non un trattamento.

Perché nessuno dei due studi dimostra un beneficio nei pazienti

Considerate ciascuno studio come una buona risposta a una domanda circoscritta, ma non come una risposta alla domanda sui pazienti.

Primo, la causa è diversa. L'EAE viene indotta deliberatamente con un antigene e un adiuvante definiti. La SM umana si sviluppa spontaneamente con un repertorio immunitario più ampio, che comprende cellule T, cellule B, immunità innata e glia residente. Un composto che modifica una risposta orientata verso MOG in un topo non modifica necessariamente quella più ampia nell'uomo.

Secondo, il fenotipo è diverso. La debolezza ascendente dalla coda agli arti posteriori in un topo è un indicatore comodo. Riduce l'eterogeneità della SM umana a un unico numero relativo alla funzione motoria. I farmaci modificano abitualmente i punteggi dell'EAE a breve termine senza cambiare il decorso nell'uomo: per questo l'EAE è uno strumento di screening e di studio dei meccanismi, non una clinica in miniatura.

Terzo, l'esposizione e le tempistiche restano da chiarire. Una somministrazione precoce e continua in un esperimento di 30 giorni sui topi non equivale all'uso orale cronico in una persona con malattia già instaurata, e nessuno dei due studi ha misurato i livelli del farmaco nel sistema nervoso. Senza questo collegamento, manca un ponte tra una concentrazione in una piastra o una dose in un topo e un regime di somministrazione nell'uomo.

Quarto, i due studi non si replicano a vicenda. Antigeni diversi, domande diverse, esiti diversi e, in un caso, nessun trattamento. Citarli insieme come due studi positivi sul trattamento della SM è un errore di categoria.

Che cosa significa per chi valuta le evidenze

Questi studi non definiscono alcun protocollo consolidato con blu di metilene per la SM. Lo studio terapeutico sostiene ulteriori ricerche su AMPK, SIRT1, NF-kB e sull'equilibrio tra Th17 e Treg nell'EAE indotta da MOG. Lo studio patologico ricorda che il danno tissutale può progredire mentre i punteggi sembrano invariati, e che il blu di metilene in una sezione sui metodi indica talvolta un barattolo di colorante anziché un armadietto dei medicinali. Chi segue la ricerca in corso sulla sclerosi multipla dovrebbe tenere presente questa distinzione tra colorante e farmaco. Le questioni di sicurezza, compresi i rischi ematologici e di interazione, vanno discusse con un medico insieme ai dati generali sulla sicurezza del blu di metilene prima di prendere decisioni sulla base di titoli riguardanti risultati di laboratorio.

La conclusione sta in una frase. Uno degli studi citati ha somministrato blu di metilene a topi con EAE indotta da MOG e ha riportato una malattia meno grave insieme a uno spostamento della risposta immunitaria in senso antinfiammatorio, mentre l'altro non ha somministrato alcun trattamento e ha usato il blu di metilene solo per colorare il midollo spinale, documentando sei mesi di accumulo del danno alla mielina e agli assoni: i due studi, quindi, non dimostrano che il blu di metilene sia utile nella SM umana.