Blu di metilene per le lesioni cerebrali: comprendere le evidenze precliniche

Un colpo alla testa, un'arteria ostruita e una malattia neurodegenerativa a lenta progressione possono tutti portare allo stesso problema: il cervello non ha più l'energia necessaria per svolgere il proprio lavoro. Questo esito comune spiega perché un composto continui a comparire in tutti e tre gli ambiti della letteratura. Ma un esito comune non equivale a un concetto comune. Un trattamento somministrato prima di una lesione, uno somministrato nell'ora successiva e uno valutato mesi dopo mettono alla prova idee diverse, anche quando la siringa contiene lo stesso liquido blu.

Questo articolo esamina la parte di quella letteratura dedicata alle lesioni. Passa in rassegna che cosa significhi usare il blu di metilene per le lesioni cerebrali negli esperimenti sugli animali, distingue le lesioni traumatiche dall'ictus e dalla neurodegenerazione cronica, e mostra perché il momento della somministrazione spieghi gran parte delle differenze tra gli studi.

Tre lesioni, un unico deficit energetico

Il meccanismo che collega questi modelli si trova all'interno dei mitocondri. Normalmente, gli elettroni percorrono la catena di trasporto degli elettroni per produrre ATP, e una catena funzionante tiene sotto controllo le specie reattive dell'ossigeno. Dopo una lesione, alcune parti della catena funzionano male, la produzione di ATP diminuisce e quella di radicali liberi aumenta. La rassegna del 2018 su Molecular Neurobiology descrive il blu di metilene come un trasportatore alternativo di elettroni: accetta elettroni dal NADH e li trasferisce al citocromo c, aumentando l'attività del complesso IV e ripristinando la sintesi di ATP anche quando la parte iniziale della catena è compromessa.

I numeri riportati sono concreti. Nei preparati cellulari e nelle sezioni di tessuto, l'attività del complesso IV è aumentata dal 30 al 100 percento, mentre il consumo di ossigeno è cresciuto di pari passo: ciò indica che gli elettroni aggiuntivi hanno svolto un lavoro utile anziché disperdersi sotto forma di radicali. In un modello di ictus nel ratto, la produzione di ATP nella regione interessata era circa il 30 percento più alta a 24 ore dal trattamento rispetto agli animali non trattati. La rassegna del 2022 su Biochemistry (Moscow) aggiunge le conseguenze a valle: meno stress ossidativo, meno neuroinfiammazione, meno apoptosi, oltre a effetti sulla monoamino ossidasi, sulla sintasi dell'ossido nitrico, sulla biogenesi mitocondriale, sull'autofagia e sull'aggregazione di proteine mal ripiegate.

Il concetto è quindi semplice. La lesione ostacola il normale percorso degli elettroni, e il blu di metilene offre una via alternativa. Tutto ciò che segue dipende dal tipo di lesione, dal momento della somministrazione e da come vengono misurati gli esiti.

La lesione traumatica non è un ictus

In un modello di lesione cerebrale traumatica, la forza agisce tutta in una volta. Il danno primario è meccanico: i tessuti si lacerano, i vasi si rompono e la barriera ematoencefalica si apre nel giro di pochi minuti. Ciò su cui il blu di metilene può plausibilmente intervenire è l'ondata secondaria che si sviluppa nelle ore e nei giorni successivi, mentre i mitocondri del tessuto sopravvissuto smettono di funzionare, l'infiammazione si diffonde e l'edema aumenta. Gli esiti valutati in questi studi riflettono questa sequenza: volume della lesione, contenuto d'acqua del cervello, sopravvivenza neuronale vicino al punto d'impatto e, in seguito, comportamento, come il recupero motorio o l'apprendimento nei labirinti.

In un modello di ictus o di ischemia globale, l'evento lesivo segue uno schema opposto. Il flusso sanguigno si interrompe, il deficit energetico compare nel giro di pochi minuti e il ripristino del flusso provoca a sua volta un danno da riperfusione. Qui la somministrazione è sincronizzata con l'evento vascolare, spesso entro pochi minuti dall'occlusione o dalla riperfusione, e gli esiti quantificano il destino acuto del tessuto nell'arco di ore o di uno o due giorni: dimensioni dell'infarto, flusso sanguigno e recupero funzionale precoce. Un approccio presente nella letteratura sull'ictus è il pretrattamento, con animali che ricevono la dose prima dell'occlusione vascolare: un modo di valutare la prevenzione che nessun esperimento sul trauma cranico potrebbe replicare eticamente negli esseri umani.

I risultati sull'ictus sono i più solidi nella letteratura sulle lesioni e comprendono anche il risultato nullo più netto. Ratti che hanno ricevuto blu di metilene al momento della riperfusione, dopo un'ora di occlusione dell'arteria cerebrale media, presentavano infarti più piccoli del 30 percento al giorno 2, con una maggiore porzione del nucleo e della penombra a rischio preservata (Shen, 2013). Uno studio con occlusione permanente ha rilevato una progressione più lenta del tessuto a rischio verso l'infarto, ma nessuna riduzione del volume finale dell'infarto a 24 ore con nessuna delle due dosi valutate (Rodriguez, 2014). Un terzo studio sull'occlusione ha ridotto le dimensioni dell'infarto di circa la metà alla dose intermedia e ha documentato direttamente l'ultrastruttura mitocondriale e la mitofagia nel cervello ischemico, riportando al contempo un dettaglio controintuitivo: l'apoptosi misurata aumentava mentre la necrosi diminuiva (Di, 2015). Nell'ischemia globale, inoltre, un'infusione continua a bassa dose ha ripristinato l'attività della citocromo c ossidasi, i livelli di ATP e il potenziale di membrana mitocondriale nella vulnerabile regione CA1 dell'ippocampo, preservando quei neuroni e proteggendo la memoria spaziale (Lu, 2016). Vale la pena soffermarsi su questa misurazione nella CA1: si tratta di dati diretti sull'ATP e sulla catena respiratoria all'interno di un cervello lesionato, che la letteratura sulla TBI perlopiù deduce anziché misurare.

La neurodegenerazione cronica è diversa da entrambe. Nei modelli delle malattie di Alzheimer, Parkinson e Huntington, gli animali ricevono dosi per settimane o mesi e si misurano l'aggregazione proteica, la gestione della dopamina o il declino cognitivo graduale. Questi esiti hanno pochissimo in comune con una lesione misurata pochi giorni dopo un impatto. Chi trasferisce un risultato da una colonna all'altra porta una scoperta oltre un confine che gli esperimenti non hanno mai attraversato. La nostra guida alla letteratura sulla neurodegenerazione mantiene questi studi a lungo termine nel loro contesto, e il confronto con le evidenze relative al solo ictus distingue in dettaglio i disegni sperimentali basati sull'ostruzione vascolare da quelli basati sull'impatto.

Che cosa hanno effettivamente fatto i modelli di TBI

Non è stato pubblicato alcuno studio clinico sull'uso del blu di metilene nelle lesioni cerebrali traumatiche umane. Tutte le evidenze sulla TBI derivano da studi sugli animali, soprattutto ratti e topi, e si concentrano su un piccolo gruppo di esperimenti che vale la pena citare, perché i loro dettagli differiscono in modi che le sintesi tendono a cancellare.

Il primo studio con impatto corticale controllato ha somministrato ai ratti 1 mg/kg per via endovenosa un'ora dopo un impatto lieve, poi 0.5 mg/kg a tre ore (Watts, 2014). Il volume della lesione rilevato con risonanza magnetica è rimasto inferiore negli animali trattati durante due settimane di osservazione. Gli errori di appoggio delle zampe in un test di camminata sono diminuiti significativamente nei giorni 1, 2 e 7, ma non al giorno 14. All'esame microscopico del giorno 14, i neuroni in degenerazione nella corteccia lesionata erano 270 contro 368 per campo, e quelli con colorazione di Nissl anomala 41 contro 73. In altre parole, una protezione precoce, con un vantaggio comportamentale che si attenuava entro la seconda settimana.

Un disegno sperimentale di lesione diffusa ha utilizzato la percussione fluida sulla linea mediana nei topi e una singola dose endovenosa di 2 mg/kg entro mezz'ora (Fenn, 2015). Gli animali trattati mostravano una minore espressione di geni infiammatori, meno microglia infiammatoria, meno edema apparente e nessun comportamento di tipo depressivo al giorno 7. I risultati nulli sono altrettanto importanti: la lesione stessa aumentava solo modestamente il contenuto d'acqua del cervello, e il blu di metilene non compensava la perdita di peso corporeo né il deficit di coordinazione motoria. Un effetto antinfiammatorio non equivale a una protezione completa.

Due studi sui topi hanno utilizzato lo stesso schema, 1 mg/kg a un'ora, 0.5 mg/kg a sei ore, poi somministrazioni quotidiane per tre giorni, e hanno approfondito il meccanismo. In un modello di impatto corticale, il trattamento ha ridotto il volume della lesione a 24 ore, 72 ore e al giorno 14, preservando i neuroni e aumentando i marcatori dell'autofagia (Zhao, 2016). In un modello di percussione fluida, ha ridotto l'apoptosi neuronale, diminuito la permeabilità di una barriera ematoencefalica compromessa e migliorato i punteggi neurologici nell'arco di due settimane (Shen, 2019). Tuttavia, nello studio di Zhao il contenuto d'acqua del cervello non mostrava differenze a 72 ore, e nello studio di Shen le prestazioni al rotarod non mostravano differenze nei giorni 1 e 3. Gli esiti relativi alla lesione e alla sopravvivenza cellulare cambiavano; il gonfiore e gli esiti motori precoci non sempre seguivano lo stesso andamento.

L'esperimento che spicca per i tempi di somministrazione è quello con somministrazione ritardata (Watts, 2016). Utilizzando lo stesso modello di impatto, la prima dose è stata rinviata fino a 24 ore dopo la lesione. Entro il giorno 2, il gruppo con trattamento ritardato mostrava riduzioni della lesione comparabili a quelle degli animali trattati nelle prime ore, e la riduzione persisteva ai giorni 7 e 14. Il segnale comportamentale era più debole: il miglioramento degli errori di appoggio nel gruppo con trattamento ritardato era una tendenza non significativa. Un laboratorio, un modello, una finestra di 24 ore. Questa è una prova concreta che la finestra si estende oltre le prime ore, ma è anche l'intera base di evidenze a sostegno di tale ipotesi. Attenzione alla trappola della parola «ritardata» in altri contesti: una serie russa incentrata nel titolo sulla neuroprotezione ritardata somministrava la dose a 30 minuti e usava «ritardata» per indicare esiti duraturi, non un inizio tardivo del trattamento.

Uno studio più piccolo su una lesione focale nei ratti completa il quadro temporale dalla direzione opposta: sia la somministrazione immediatamente prima della lesione sia quella 30 minuti dopo hanno ridotto la disfunzione degli arti (Stelmashook, 2019). Il pretrattamento funziona in laboratorio proprio perché è il laboratorio a programmare la lesione.

Qui il rigore nel dosaggio conta. Le rassegne descrivono le basse dosi come stimolanti della respirazione mitocondriale e le alte dosi come inibitorie, lo stesso andamento bifasico osservato in tutta la farmacologia del blu di metilene. Per questo i risultati non si possono interpretare come «più blu, più recupero». Ogni studio valuta un punto di una curva. L'approfondimento sulla relazione dose-risposta segue questa curva nei diversi modelli, mentre il profilo di sicurezza ed effetti collaterali descrive che cosa fanno invece le dosi più alte.

Leggete la tabella da una riga all'altra: lo stesso composto, tre tempi diversi. La prevenzione appartiene alla riga centrale, il trattamento immediato alle prime due e gli esiti tardivi alla prima e alla terza.

Prevenzione, trattamento immediato, esiti tardivi

La prevenzione è l'affermazione più facile da fraintendere. Nei modelli di ischemia, gli animali che ricevono la dose prima dell'occlusione vascolare hanno esiti migliori, e questo risultato viene talvolta citato come se il blu di metilene proteggesse qualsiasi cervello da qualsiasi evento lesivo futuro. Non dimostra nulla del genere. Mostra che i mitocondri preparati con una via alternativa per gli elettroni tollerano meglio una perdita programmata del flusso sanguigno. Nessuno programma un trauma cranico.

Il trattamento immediato è l'ambito in cui si concentrano le evidenze sulla TBI. La somministrazione nelle ore successive all'impatto mira alla cascata del danno secondario mentre è ancora in corso: deficit energetico, stress ossidativo, infiammazione, gonfiore. I miglioramenti degli esiti relativi alla lesione e all'edema sono autentici effetti del trattamento, ma si tratta del trattamento di un processo, non dell'annullamento di una lacerazione del tessuto.

Gli esiti tardivi costituiscono il terzo concetto. Il comportamento misurato settimane dopo la lesione, o la gestione delle proteine misurata dopo mesi in un modello degenerativo, indica se la protezione precoce è persistita o se processi lenti hanno cambiato corso. Una lesione più piccola a 24 ore, una tendenza comportamentale non significativa dopo una dose ritardata di 24 ore e un miglioramento nei labirinti dopo mesi di somministrazione cronica sono tre affermazioni diverse, con tre diversi livelli di prova richiesti, e solo la prima attualmente raggiunge il proprio livello più di una volta.

Che cosa queste evidenze non possono dimostrare

Ogni risultato riportato sopra ha lo stesso limite. I mitocondri dei roditori rispondono al blu di metilene in modi che i mitocondri umani potrebbero condividere, ma un ratto che riceve una dose endovenosa pochi minuti dopo un impatto calibrato non è una persona che arriva al pronto soccorso ore dopo una caduta. L'anestesia, la gravità controllata della lesione, l'uso di animali giovani e sani e la breve durata dell'osservazione limitano tutti la trasferibilità dei risultati. Non esiste alcuno studio sul blu di metilene nelle lesioni da esplosione, quindi il tipo di lesione più rilevante per i lettori in ambito militare è quello con meno evidenze.

Non viene nemmeno proposta una conversione delle dosi. La letteratura animale utilizza vie endovenose e intraperitoneali, con dosi scelte per il controllo sperimentale, non le gocce orali vendute al dettaglio. Nulla in questi studi definisce uno schema di trattamento umano, e nessuno di essi valuta il blu di metilene insieme alle cure standard per il trauma cranico.

La sintesi onesta sta quindi in un paragrafo. Nei roditori, il blu di metilene somministrato in prossimità di una lesione cerebrale traumatica o ischemica preserva la produzione energetica mitocondriale, e questa preservazione è seguita da lesioni più piccole e migliori punteggi di recupero. Uno studio sull'impatto ha mantenuto parte dell'effetto sulla lesione con una prima dose ritardata di 24 ore. Non è stato verificato se qualcosa di tutto questo avvenga nei cervelli umani lesionati, e le letterature sulla TBI e sull'ictus valutano tempi diversi rispetto a esiti diversi. Chiunque venda certezze sulla base di queste evidenze aggiunge un ingrediente che gli esperimenti non hanno mai contenuto.