Blu di metilene e ferroptosi: ferro, perossidazione lipidica e morte cellulare

La ferroptosi è una morte cellulare dovuta al danno alle membrane. I grassi polinsaturi delle membrane si ossidano in una reazione a catena, la membrana cede e la cellula muore. Il ferro è necessario per queste reazioni chimiche. Questa frase racchiude l'intero concetto, e tutto ciò che viene descritto in questo articolo mette alla prova una sua parte.

Qui la domanda è più circoscritta: che cosa fa il blu di metilene a questa catena negli esperimenti cellulari, e che cosa dimostra davvero il risultato? La risposta breve è che, in due studi di laboratorio, il blu di metilene a concentrazioni nanomolari ha ridotto la perossidazione lipidica mitocondriale e mantenuto in vita le cellule dopo stimoli che altrimenti causano ferroptosi. La risposta più articolata conta di più, perché ogni anello della catena è stato verificato con un intervento diverso, e ogni intervento ha dei limiti.

La ferroptosi in un paragrafo

Un fosfolipide di membrana che presenta una coda di acido grasso polinsaturo ha un punto debole: atomi di idrogeno facili da sottrarre. Quando un radicale ne sottrae uno, l'ossigeno si lega al lipide, si forma un radicale perossilico lipidico e quel radicale sottrae un atomo di idrogeno al lipide successivo. La reazione si propaga lungo la membrana, a meno che qualcosa non la fermi.

Il principale freno è un enzima chiamato GPX4, che usa il glutatione per ridurre i perossidi lipidici ad alcoli lipidici innocui. Gli stimoli usati in laboratorio attaccano questa difesa in punti definiti. L'erastina blocca l'importazione della cistina attraverso il sistema xc-minus, privando la cellula della cisteina necessaria alla sintesi del glutatione. La butionina sulfoximina blocca direttamente la sintesi del glutatione. RSL3 inibisce la stessa GPX4. Tutti e tre lasciano i perossidi non rimossi, ma agiscono in passaggi diversi: un risultato ottenuto con uno stimolo non si può quindi generalizzare automaticamente agli altri.

La ferroptosi si distingue dall'apoptosi per le proprietà che la definiscono. Non ci sono né una cascata di caspasi né corpi apoptotici. I chelanti del ferro, come la deferoxamina, e gli agenti che intrappolano i radicali, come la ferrostatina-1, la sopprimono: è questa la prova operativa che i ricercatori usano per definire una morte ferroptotica anziché semplicemente necrotica. Il quadro più ampio delle vie di morte cellulare regolata permette di contestualizzare questa distinzione, mentre il modo in cui le cellule gestiscono il ferro labile spiega perché la chelazione sia un controllo così decisivo.

Il ruolo dei mitocondri e perché era controverso

I primi lavori riportavano che le cellule prive di DNA mitocondriale vanno comunque incontro a ferroptosi, suggerendo che i mitocondri non fossero indispensabili. Lavori successivi hanno rilevato che eliminare i mitocondri, o bloccare la respirazione, può sopprimere la ferroptosi dovuta alla carenza di cisteina, ma non quella dovuta all'inibizione diretta di GPX4. Entrambi i risultati possono essere veri se il contributo mitocondriale dipende dallo stimolo, dal tipo cellulare e dal luogo in cui avviene la perossidazione decisiva.

Lo studio su cui si basa questo articolo ha affrontato la controversia con una sonda specifica per compartimento. MitoCLox è una versione diretta ai mitocondri di un indicatore della perossidazione lipidica: la sua fluorescenza cambia quando incontra radicali perossilici lipidici all'interno dei mitocondri. Nei fibroblasti trattati con erastina, l'ossidazione della sonda mitocondriale compariva in cellule ancora vive, prima della morte, ed era eterogenea nella popolazione. Questa sequenza temporale è importante. La perossidazione che precede la morte è una possibile causa. Quella misurata soltanto nelle cellule morte è un residuo. Una guida complementare ai saggi di perossidazione lipidica e a ciò che rileva ciascuna sonda spiega perché la posizione della sonda determina il significato di un segnale.

Lo stesso andamento è comparso in un secondo modello. I fibroblasti di un paziente con neuropatia ottica ereditaria di Leber, portatori di una mutazione del complesso I e caratterizzati da uno stress ossidativo basale più elevato, morivano per ferroptosi quando il glutatione veniva esaurito, mentre i fibroblasti di controllo resistevano. Ancora una volta, l'ossidazione della sonda mitocondriale avveniva per prima. I dettagli si trovano nello studio sui fibroblasti e sulla perossidazione lipidica mitocondriale nella ferroptosi.

Che cosa ha modificato il blu di metilene in questi esperimenti

Il blu di metilene è un trasportatore redox. La sua forma ossidata accetta elettroni dalle reazioni legate al NADH a livello del complesso I, mentre la sua forma ridotta li dona al citocromo c, che rifornisce il complesso IV. Si crea così un bypass parziale del tratto della catena in cui gli elettroni normalmente sfuggono verso l'ossigeno, formando superossido. Chi desidera un quadro completo di questo trasferimento può iniziare da come il blu di metilene trasferisce gli elettroni attraverso i mitocondri.

Nei fibroblasti polmonari trattati con erastina, il blu di metilene a una concentrazione di 250 nanomolare ha preservato la vitalità in un saggio di sopravvivenza cellulare, così come gli antiossidanti diretti ai mitocondri SkQ1 e MitoTEMPO. I controlli delimitano la conclusione. Anche ferrostatina-1, alfa-tocoferolo e deferoxamina hanno esercitato un effetto protettivo, confermando che la morte era ferroptotica. L'analogo di SkQ1 privo di un gruppo antiossidante non ha protetto le cellule, indicando un ruolo della chimica redox anziché dell'accumulo aspecifico. La protezione si attenuava oltre una concentrazione di SkQ1 di circa 200 nanomolare, coerentemente con il comportamento pro-ossidante noto degli antiossidanti chinonici a livelli più elevati. Il blu di metilene mostra la stessa duplicità in funzione della dose: protettivo a basse concentrazioni nanomolari in queste colture, ma capace di generare perossido di idrogeno attraverso cicli redox a concentrazioni maggiori o sotto illuminazione intensa. Questo tipo di contesto relativo alla dose è trattato in specie reattive dell'ossigeno nei mitocondri.

Gli esperimenti sui mitocondri isolati hanno poi distinto le fonti di ROS. In presenza di ferro ferroso, i substrati che alimentavano il complesso I, insieme al rotenone, stimolavano l'ossidazione della sonda. Il rotenone blocca il flusso a valle del sito flavinico, perciò i trasportatori a monte rimangono ridotti e gli elettroni sfuggono verso l'ossigeno dalla flavina rivolta verso la matrice. I substrati che alimentavano il complesso III, insieme all'antimicina A, producevano abbondante perossido di idrogeno, ma non inducevano perossidazione lipidica. Stesso segnale complessivo di ROS, posizione diversa, esito diverso. Sia SkQ1 sia il blu di metilene sopprimevano la perossidazione indotta dal complesso I senza sopprimere la produzione di perossido di idrogeno, collocando la loro azione dopo la formazione delle ROS, nella fase di perossidazione lipidica.

Il filone del sovraccarico di ferro e l'indizio della lipofuscina

Un secondo studio ha affrontato la domanda dal versante del ferro. I cardiomiociti H9c2 esposti a citrato ferrico ammonico a concentrazioni submillimolari sviluppavano ROS mitocondriali, perossidazione lipidica mitocondriale e poi ferroptosi, seguita dall'accumulo di un pigmento simile alla lipofuscina entro 24 ore. La lipofuscina è il residuo autofluorescente, contenente ferro, di lipidi e proteine ossidati che si accumula con l'età; la sua rapida comparsa in questo contesto collega la perossidazione acuta indotta dal ferro a un classico marcatore dell'invecchiamento. Sia il blu di metilene a concentrazioni nanomolari sia SkQ1 impedivano la perossidazione, la morte e l'accumulo del pigmento. I mitocondri cardiaci isolati hanno confermato questo andamento: il rotenone insieme al ferro ferroso induceva perossidazione e un segnale simile a quello del pigmento, ed entrambi gli agenti lo bloccavano. La sequenza completa è riportata nello studio sul sovraccarico di ferro nei cardiomiociti H9c2. L'aspetto relativo al pigmento si inserisce nel tema della lipofuscina e dei marcatori dell'invecchiamento cellulare.

Che cosa non mostrano i saggi di sopravvivenza cellulare

Una misura di vitalità come CellTiterBlue indica quante cellule in una piastra rimangono metabolicamente attive dopo uno stimolo insieme a un possibile agente protettivo. È una verifica di un meccanismo in un sistema definito. Non è l'esito di un trattamento. Nessuno di questi esperimenti ha somministrato una dose a un paziente, misurato un esito clinico o stabilito una finestra terapeutica in un organismo.

Quattro limiti meritano di essere dichiarati esplicitamente. Primo, i tipi cellulari sono pochi e specifici: fibroblasti polmonari trasformati, fibroblasti cutanei primari comprendenti una linea con malattia mitocondriale e una linea di cardiomiociti di ratto, oltre a mitocondri isolati dal cuore di ratto. La sensibilità variava da una linea all'altra, e la linea LHON era stata scelta proprio per la sua vulnerabilità insolita. Secondo, gli stimoli sono condizioni estreme di laboratorio: blocco completo del trasporto o della sintesi, e carichi di ferro a cui nessun tessuto sarebbe esposto acutamente. Terzo, una concentrazione non si converte in una dose con una semplice moltiplicazione. Una concentrazione nanomolare nel terreno di coltura non è una dose per l'essere umano, e tra una piastra e una persona intervengono la distribuzione del blu di metilene, la sua riduzione alla forma incolore nel sangue e nei tessuti, l'esposizione alla luce e il potenziale di membrana. Quarto, le sonde rilevano ciò che avviene nel proprio compartimento. L'ossidazione di MitoCLox mostra che si sono formati radicali lipidici mitocondriali; non mostra che la rottura della membrana plasmatica, il probabile evento terminale, sia stata impedita direttamente anziché evitata agendo a monte.

La conclusione rigorosa è quindi questa: in questi modelli, le ROS derivate dal complesso I insieme al ferro inducono una perossidazione lipidica mitocondriale che precede la ferroptosi, e il blu di metilene a basse concentrazioni interrompe quel tratto della catena. Qualsiasi conclusione che vada oltre quel tratto richiede esperimenti diversi negli animali e poi nelle persone.