Blu di metilene e diabete: cosa mostrano gli studi su cellule e animali

La domanda dietro il clamore

Quella conclusione sembra logica, ma si basa su un modello mentale errato. Tratta tre concetti diversi come se fossero uno solo: l'ingresso del glucosio in una singola cellula in una piastra, il metabolismo all'interno di un mitocondrio cardiaco e il controllo del glucosio in una persona nel suo insieme. Ciascuno ha misure e limiti propri. Questo articolo li distingue.

La risposta breve: il blu di metilene attiva effettivamente il trasporto del glucosio in una linea cellulare ben studiata e modifica la chimica mitocondriale e alcuni parametri cardiaci nei ratti diabetici. Ma nello studio più lungo sui ratti non ha modificato la glicemia a digiuno né l'emoglobina glicata, e nessuna evidenza pubblicata sull'uomo dimostra che il blu di metilene somministrato per via sistemica migliori la glicemia, l'HbA1c o l'insulina nel diabete.

Cellule: ingresso più rapido del glucosio attraverso trasportatori già presenti nella membrana

I ricercatori hanno utilizzato fibroblasti L929, una linea il cui assorbimento del glucosio dipende da un unico trasportatore, GLUT1. In presenza di un solo trasportatore, qualsiasi variazione dell'assorbimento deve dipendere da quel trasportatore.

Quando il gruppo ha esposto queste cellule al blu di metilene, l'assorbimento del tracciante è aumentato entro 10 minuti e in modo dipendente dalla dose, raggiungendo circa l'800 percento del valore basale a 50 micromolar per 45 minuti. Il dettaglio cinetico è importante: la velocità massima (Vmax) è aumentata, mentre l'affinità (Km) e la quantità della proteina GLUT1 sono rimaste invariate. Lo stesso numero di porte lasciava passare più glucosio al minuto. Il colorante ha attivato i trasportatori già presenti nella membrana, anziché aggiungerne di nuovi.

I controlli chiariscono il quadro. La forma ridotta (incolore) non ha avuto alcun effetto. Un ossidante extracellulare che impediva al colorante di entrare ha bloccato sia la colorazione sia la stimolazione. Gli inibitori delle vie della chinasi AMP e della chinasi PI non hanno modificato nulla, un risultato che depone contro il coinvolgimento di queste due note vie di segnalazione.

La prima ipotesi riguardava il ciclo redox: il colorante trasferisce elettroni, sottopone la cellula a un lieve stress e le cellule stressate aprono le porte al glucosio. Uno studio successivo ha verificato questa idea. I ricercatori hanno utilizzato la metil-beta-ciclodestrina, una molecola ad anello che intrappola il blu di metilene in un complesso di inclusione (costante di associazione vicina a 310 M-1). Il colorante intrappolato non colorava le cellule né stimolava l'assorbimento, e la sua rimozione mediante lavaggio era strettamente correlata alla perdita dell'effetto. La loro conclusione contrastava con l'ipotesi redox: l'attivazione probabilmente deriva da un'interazione diretta del colorante con una proteina della via di attivazione di GLUT1, non da uno stress ossidativo generale.

Il principio operativo ha una portata limitata. Il blu di metilene può attivare in modo acuto e reversibile l'assorbimento mediato da GLUT1 nelle cellule L929 attraverso l'ingresso nella cellula e un'interazione a livello proteico. Questo non dice nulla sull'insulina, sul pancreas o sulla glicemia in un animale vivo. Per approfondire il ruolo del colorante come trasportatore di elettroni, vedere come il blu di metilene agisce da trasportatore di elettroni. Per i criteri di lettura degli studi cellulari, vedere come leggere la ricerca sul blu di metilene.

Ratti diabetici: cuore modificato, glicemia invariata

La ricerca sugli animali passa a un concetto diverso: il cuore diabetico. Entrambi gli studi sui ratti hanno utilizzato la streptozotocina, una tossina che distrugge le cellule beta produttrici di insulina e crea uno stato simile al diabete di tipo 1. Chi cerca informazioni sul blu di metilene e sul diabete di tipo 2 dovrebbe notare questa discrepanza fin dall'inizio. Questi animali non hanno un diabete di tipo 2.

Nello studio cronico, ratti Lewis maschi hanno ricevuto 10 mg per kg al giorno nell'acqua da bere per 11 settimane, con piccole dosi di insulina per prevenire il deperimento senza normalizzare il glucosio. Nei mitocondri cardiaci il colorante ha favorito l'ossidazione del NADH, aumentato il NAD+ e incrementato l'attività deacetilasica della sirtuina 3. L'analisi proteomica ha rilevato una minore acetilazione in 83 siti su 34 proteine mitocondriali coinvolte nell'ossidazione dei grassi, nel ciclo dell'acido citrico e nel trasporto degli elettroni. L'ossidazione dei grassi a catena lunga e l'attività dell'idrossiacil-CoA deidrogenasi sono diminuite, un risultato interpretato come attenuazione della rigida dipendenza eccessiva dai grassi del cuore diabetico. I volumi e la frazione di eiezione sono migliorati e un marcatore di ipertrofia si è normalizzato, mentre le pressioni e la velocità di contrazione sono rimaste ridotte.

Ecco il risultato più importante: la glicemia non è cambiata. Il glucosio a digiuno e non a digiuno è rimasto elevato, e l'HbA1c è rimasta vicina al 5.6 percento sia nei ratti diabetici trattati sia in quelli non trattati, senza un effetto significativo del trattamento. Il colorante non ha neppure corretto il difetto di respirazione dei complessi I e II nei mitocondri isolati. La funzione cardiaca è migliorata secondo alcune misure, mentre il controllo del glucosio e il difetto respiratorio di base non sono migliorati. Gli esiti distinti sono rimasti tali.

Il secondo studio ha lavorato su scala più ridotta: mitocondri isolati da cuori sani e da cuori diabetici da due mesi, ai quali è stata somministrata una singola dose bassa di 0.1 micromolar durante la misurazione. Il consumo di ossigeno è aumentato sia con i substrati del complesso I sia con quelli del complesso II. Ma il rilascio di perossido di idrogeno variava in base al combustibile: aumentava con glutammato più malato, diminuiva con succinato. La ritenzione di calcio non è cambiata. Si tratta di farmacologia mitocondriale, non di uno studio sulla funzione cardiaca o sul glucosio. La lezione è che il colorante non è un antiossidante dagli effetti uniformi. L'aumento o la diminuzione del rilascio di ossidanti dipende dal substrato utilizzato dal mitocondrio. Per un approfondimento correlato, vedere il blu di metilene nella ricerca cardiovascolare.

Tabella dei modelli e degli endpoint: cosa è stato testato, cosa è cambiato e cosa no

Modello	Cosa ha fatto il blu di metilene	Endpoint misurato	Risultato
Fibroblasti L929, solo GLUT1, assorbimento del tracciante	Attivazione acuta dei trasportatori esistenti, Vmax aumentata, Km invariata, nessuna nuova proteina GLUT1	Velocità di assorbimento del glucosio nella piastra	Aumentata fino a ~8 volte a 50 micromolar, reversibile con il lavaggio
Fibroblasti L929 con intrappolamento mediante ciclodestrina	Colorante sequestrato all'esterno delle cellule, colorazione scomparsa	Stimolazione dell'assorbimento	Bloccata insieme alla colorazione; favorisce l'ipotesi di un'interazione proteica diretta rispetto allo stress redox generale
Ratti diabetici da STZ, 10 mg/kg/day per via orale, 11 settimane	Ossidazione del NADH, aumento del NAD+, maggiore attività della sirtuina 3, 83 siti mitocondriali deacetilati, ridotta ossidazione dei grassi a catena lunga	Volumi cardiaci, frazione di eiezione, marcatore di ipertrofia	Parzialmente migliorati (volumi, frazione di eiezione, ANP normalizzato; pressioni e dP/dt ancora ridotti)
Stesso studio cronico sui ratti	Stessa somministrazione	Glucosio a digiuno, glucosio non a digiuno, HbA1c	Nessuna variazione significativa; il diabete è rimasto tale
Stesso studio cronico sui ratti, mitocondri isolati	Somministrazione orale cronica, seguita da misurazione della respirazione ex vivo	Fosforilazione ossidativa sostenuta dai complessi I e II	Difetto non corretto
Mitocondri isolati da cuori sani e diabetici, 0.1 micromolar in acuto	Reindirizzamento degli elettroni durante la respirometria	Consumo di ossigeno	Aumentato con i substrati dei complessi I e II
Stesso studio mitocondriale acuto	Stessa somministrazione	Rilascio di perossido di idrogeno	Dipendente dal substrato: aumentato con glutammato/malato, diminuito con succinato
Esseri umani, somministrazione sistemica	Nessuno studio pubblicato con un esito primario glicemico e risultati disponibili	HbA1c, glucosio a digiuno, insulina	Nessun miglioramento riscontrato nelle pubblicazioni

Persone: le evidenze glicemiche sull'uomo sono quasi assenti

Uno studio può esaminare le ferite nelle persone con diabete senza studiare il controllo del glucosio, e una procedura odontoiatrica può riportare l'HbA1c come misura secondaria senza valutare una terapia per il diabete.

Uno studio registrato, NCT05850611, prevede blu di metilene per via orale (70 mg nel latte, quattro settimane) per l'ulcera del piede diabetico, includendo tra le misure il glucosio a digiuno, l'insulina e l'HbA1c, ma non riporta risultati. Un piccolo studio pilota pubblicato ha combinato un gel di plasma ricco di piastrine con il colorante orale a bassa dose per l'ulcera del piede, riportando esiti relativi alla ferita e all'ossigenazione, non alla glicemia. Studi odontoiatrici che hanno applicato il colorante localmente come antimicrobico attivato dalla luce in pazienti con parodontite e diabete non hanno riscontrato alcun vantaggio significativo sull'HbA1c. Un colorante applicato in una tasca gengivale è un concetto diverso da una terapia metabolica sistemica, quindi anche questi risultati nulli non dicono nulla sulla somministrazione orale.

La sintesi onesta: nessuna evidenza pubblicata sull'uomo dimostra che il blu di metilene somministrato per via sistemica migliori l'HbA1c, il glucosio a digiuno o l'insulina nel diabete. L'assenza di prove non dimostra l'assenza di un effetto, ma smentisce il marketing che presenta l'assorbimento cellulare o i risultati sul cuore dei ratti come prova del controllo del glucosio. Per i limiti di sicurezza da conoscere prima di qualsiasi sperimentazione, compreso il rischio di sindrome serotoninergica con antidepressivi comuni, vedere sicurezza del blu di metilene e interazioni farmacologiche.

Come usare queste evidenze senza ingannarsi

Pensate a tre macchine. La prima macchina è una porta per il glucosio in una cellula coltivata. La seconda macchina è un mitocondrio nel cuore di un ratto. La terza macchina è una persona con diabete, con pancreas, fegato, muscoli, reni, farmaci e pasti. È dimostrato che il colorante agisce sulle prime due macchine. Non è stato dimostrato che la terza risponda con un migliore controllo del glucosio.

Questa distinzione riassume l'articolo in un paragrafo. Un'affermazione sull'impiego del blu di metilene nella cura del diabete che rimanda all'attivazione dei trasportatori o all'acetilazione mitocondriale anziché a un endpoint glicemico ha cambiato argomento. I risultati sulla sirtuina 3 e sull'ossidazione dei grassi restano degni di attenzione, ma l'esperimento da cercare è preciso: uno studio controllato su persone con diabete che misuri l'HbA1c, il glucosio a digiuno o l'insulina come esito primario.