Perché l'assorbimento del blu di metilene cambia con la concentrazione

Prendete una bottiglia di soluzione madre di blu di metilene e versatela in due bicchieri. Riempite il primo con la soluzione madre e il secondo con una diluizione di dieci volte. Il secondo bicchiere è più chiaro, come previsto. Osservando attentamente, però, si nota un altro cambiamento. La tonalità è diversa. Una soluzione tende a un azzurro cielo limpido e l'altra a un blu con sfumature violette. La diluizione non ha soltanto ridotto l'intensità. Ha cambiato la specie chimica responsabile della maggior parte dell'assorbimento.

Il concetto alla base di questo cambiamento è semplice. Il blu di metilene disciolto non è costituito da un'unica specie. Il singolo catione del colorante, chiamato monomero, può impilarsi faccia a faccia con un secondo catione per formare un dimero, e i dimeri possono crescere fino a formare aggregati più grandi. Ogni forma ha il proprio spettro di assorbimento. Ciò che uno spettrofotometro misura è la somma dei contributi della miscela presente in quella cuvetta, in quelle condizioni. Cambiando la miscela, lo spettro si modifica, anche quando il contenuto totale di colorante segue un semplice rapporto di diluizione.

Monomero e dimero assorbono in modo diverso

Immaginate il monomero come una carta piatta con una carica positiva distribuita sul suo sistema di anelli. Due carte di questo tipo possono disporsi faccia a faccia. Le cariche positive si respingono, ma le superfici aromatiche piane si attraggono attraverso interazioni di impilamento, mentre l'acqua circostante e i controioni schermano la repulsione. Il risultato è una coppia legata con stati elettronici condivisi. Le sue transizioni consentite si trovano a un'energia superiore rispetto alla transizione del monomero, quindi la banda del dimero compare a una lunghezza d'onda più corta rispetto a quella del monomero; gli aggregati più grandi contribuiscono ulteriormente verso il lato blu dello spettro, sotto forma di una spalla.

A concentrazioni molto basse in acqua pulita, prevalgono i monomeri e domina la banda a lunghezza d'onda maggiore. All'aumentare della concentrazione totale, la forma appaiata rappresenta una quota crescente e la banda a lunghezza d'onda minore aumenta rispetto alla prima. Il rapporto tra le due bande indica quindi la composizione della miscela, non direttamente la concentrazione totale. Una lettura a una sola lunghezza d'onda non può distinguere le due forme senza un'ipotesi su quale sia presente.

Ecco perché gli spettri di riferimento devono sempre essere accompagnati dalle condizioni di misura. Il riferimento spettrale per il blu di metilene riporta in tabella le posizioni delle bande insieme a solvente, composizione salina, pH, temperatura e intervallo di concentrazione da cui sono state ottenute. Citare un picco senza queste condizioni significa fornire un valore non sufficientemente definito. Due laboratori possono entrambi descrivere correttamente spettri diversi dello stesso colorante, perché hanno misurato miscele diverse.

Che cosa sposta l'equilibrio

La concentrazione è la leva principale. Per formare un dimero devono incontrarsi due monomeri, quindi la sua quota aumenta più che linearmente con il colorante totale. Le costanti di dimerizzazione in acqua riportate in letteratura sono dell'ordine delle migliaia per molare vicino alla temperatura ambiente, perciò la quota di dimero cresce rapidamente nell'intervallo micromolare. Un ampio adattamento globale dei dati, esteso da concentrazioni micromolari a millimolari di colorante, ha rilevato un contributo non nullo del tetramero già al di sotto di 34 micromolare: un avvertimento a non affidarsi a un modello rigorosamente a due specie a concentrazioni di decine di micromolare. Le frazioni esatte dipendono dal mezzo; per questo l'articolo indica le tendenze anziché fornire una tabella di conversione universale.

Il sale è la seconda leva. Gli ioni disciolti schermano la repulsione tra due cationi, quindi l'aggiunta di cloruro di sodio e di elettroliti simili sposta la miscela verso dimeri e aggregati a parità di concentrazione del colorante. Questo effetto è visibile negli studi sull'aggregazione del blu di metilene in mezzi salini e acquosi, nei quali sono state misurate concentrazioni di colorante da circa 1 micromolare a 3.4 millimolare, con concentrazioni di cloruro di sodio da 0 a 0.15 molare. In quel modello, la frazione di tetramero ha raggiunto circa 0.93 nella condizione con concentrazioni elevate sia di colorante sia di sale. Uno spettro registrato in acqua e uno registrato in soluzione fisiologica non sono quindi riferimenti intercambiabili.

La temperatura agisce in senso opposto. L'impilamento libera acqua legata ed è contrastato dal moto termico, quindi riscaldare una soluzione in genere dissocia una parte dei dimeri in monomeri, mentre il raffreddamento favorisce l'associazione. L'entalpia di dissociazione ricavata dall'adattamento dei dati è negativa, circa meno 30 kilojoule per mole nell'intervallo da 282 a 333 kelvin, il che conferma un'associazione esotermica. Un campione freddo misurato subito dopo la refrigerazione può apparire più aggregato rispetto allo stesso campione misurato dopo l'equilibratura a temperatura ambiente.

Il solvente stabilisce le condizioni di base. L'acqua, con il suo forte effetto idrofobico, favorisce l'impilamento dei cationi planari del colorante. Alcoli come etanolo e metanolo solvatano meglio gli anelli e disgregano gli aggregati, quindi la stessa concentrazione di colorante appare più monomerica in etanolo che in acqua. I cosolventi aprotici fanno lo stesso: in miscele di acqua e DMSO a 293 kelvin, l'aggiunta di DMSO ha soppresso la dimerizzazione, indicando il ruolo della struttura dell'acqua nel favorire l'impilamento. I tensioattivi richiedono attenzione in entrambe le direzioni. Al di sopra della loro concentrazione micellare critica, le micelle possono solubilizzare singolarmente i monomeri e ripristinare uno spettro simile a quello del monomero. Al di sotto di quel punto, un tensioattivo con carica opposta può invece favorire l'impilamento: con il colorante a 100 micromolare, la polimerizzazione indotta da SDS ha raggiunto un massimo intorno a 4 millimolare di SDS, circa la metà della concentrazione micellare critica, prima di una ridistribuzione a livelli più elevati di tensioattivo. Il lavoro sugli effetti del solvente e dei mezzi organizzati sugli spettri del blu di metilene mostra quanto l'ambiente molecolare immediato, e non soltanto la concentrazione complessiva, determini le bande osservate.

Il pH conta soprattutto agli estremi. Nell'intervallo prossimo alla neutralità utilizzato nella maggior parte delle attività di laboratorio, il blu di metilene rimane nella sua consueta forma cationica blu e l'aggregazione domina il comportamento spettrale. Acidi o basi forti, reazioni redox che producono la forma leuco incolore, oppure il legame con proteine e particelle aggiungono ciascuno stati ulteriori rispetto alla coppia monomero-dimero. Quando uno spettro cambia dopo l'aggiunta di un tampone, controllate la composizione del tampone per verificare la presenza di sali e componenti capaci di legare il colorante prima di attribuire tutto al solo pH. Il riferimento sulla chimica e sulla protonazione mantiene queste questioni di identità chimica separate dal problema dell'aggregazione trattato qui.

Perché la retta di Beer-Lambert si incurva

La relazione di Beer-Lambert afferma che l'assorbanza è uguale al prodotto tra coefficiente di assorbimento, concentrazione e cammino ottico. È una legge di conteggio. Presuppone che gli oggetti contati rimangano identici al variare del loro numero: una sola specie assorbente, uno spettro fisso, nessuna trasformazione chimica al variare della concentrazione, luce di misura monocromatica, assenza di diffusione o riemissione e luce che attraversi effettivamente il cammino dichiarato.

L'aggregazione viola la prima ipotesi. Formalmente, l'assorbanza totale resta una somma dei contributi delle specie: il cammino ottico moltiplicato per ciascun coefficiente di assorbimento e per la concentrazione della relativa specie. Ogni specie obbedisce alla legge. La miscela no, perché le concentrazioni delle singole specie sono funzioni non lineari del colorante totale. Una curva di calibrazione dell'assorbanza alla banda del monomero rispetto al colorante totale parte quindi come una retta nel limite delle soluzioni diluite e si incurva verso il basso all'aumentare della concentrazione, perché ogni incremento aggiunto apporta proporzionalmente meno monomero. Una curva misurata alla banda del dimero si incurva nella direzione opposta. Gli studi sull'aggregazione indicano proprio questo meccanismo come origine delle deviazioni osservate dalla legge di Lambert-Beer. Adattare una retta alla regione curva ed estrapolarla è l'errore tipico. La retta è valida soltanto nell'intervallo e nella matrice in cui è stata costruita.

La diluizione crea un'insidia correlata. Diluire una soluzione madre concentrata per rientrare nell'intervallo dello strumento non conserva il rapporto tra le specie. Nella cuvetta diluita l'equilibrio si sposta verso il monomero, quindi lo spettro descrive correttamente il campione diluito, ma non la soluzione madre. Ricalcolare lo spettro della soluzione madre moltiplicando le assorbanze per il fattore di diluizione consente di risalire alla stima del contenuto totale soltanto se la calibrazione tiene già conto di questo spostamento. Non ripristina mai la forma originale delle bande. Chi confronta lo spettro di un concentrato con un riferimento diluito sta confrontando due miscele diverse.

Il cammino ottico fa parte del risultato

L'assorbanza varia in proporzione alla distanza percorsa dalla luce nel campione. Una cuvetta da 10 mm fornisce un'assorbanza dieci volte maggiore rispetto a una cuvetta da 1 mm contenente la stessa soluzione. Questa proporzionalità è esatta soltanto per la stessa soluzione, e l'aggregazione rende tale precisazione essenziale.

In pratica, il cammino ottico è uno strumento per restare nell'intervallo valido. Un cammino lungo offre sensibilità per soluzioni diluite, prevalentemente monomeriche. Un cammino corto mantiene un campione concentrato entro la scala di misura senza una forte diluizione che ristabilirebbe l'equilibrio. Il programma di studi sull'aggregazione da cui provengono i numeri riportati sopra ha adottato proprio questo approccio: celle da 1 centimetro per concentrazioni di colorante da 1.1 a 34 micromolare e celle da 0.01 centimetro per concentrazioni da 94 micromolare a 3.4 millimolare. Le piattaforme per microvolumi e i lettori di micropiastre introducono una propria geometria, con cammini corti e talvolta variabili, oltre a superfici sulle quali il colorante cationico può adsorbirsi. Riportate il cammino ottico insieme al valore, così come il riferimento spettrale riporta solvente e sale. Un'assorbanza senza cammino ottico non è un risultato. È una voce non verificata.

Il rigore nella misurazione deriva dal meccanismo. Portate i campioni all'equilibrio alla stessa temperatura prima della lettura. Utilizzate lo stesso tipo di cuvetta e lo stesso orientamento, bianchi corrispondenti con la stessa composizione salina e lo stesso tampone, e vetreria pulita, perché il blu di metilene si adsorbe su vetro e plastica e una cuvetta macchiata conserva una memoria dell'ultimo campione concentrato. Effettuate la lettura subito dopo la preparazione quando la cinetica di aggregazione è rilevante, e costruite ogni curva di calibrazione nella stessa matrice e con lo stesso cammino ottico dei campioni incogniti. Per i controlli visivi, ricordate che l'occhio è uno spettrometro poco affidabile. La questione se il colore della soluzione possa stabilirne la purezza è distinta e ha una risposta negativa; i cambiamenti di tonalità dovuti all'aggregazione sono una delle ragioni.

Un diagramma da tenere accanto allo strumento

La figura seguente riassume l'articolo in un unico riferimento da banco. Tre soluzioni contengono lo stesso colorante, ma differiscono per concentrazione totale e composizione salina. I loro spettri schematici mostrano la banda del monomero a lunghezza d'onda maggiore perdere peso a favore della banda del dimero a lunghezza d'onda minore con l'aumentare dell'impilamento. Le condizioni sono riportate nella figura perché, senza di esse, le curve non possono essere riutilizzate. Per le posizioni delle bande misurate in condizioni dichiarate, consultate il riferimento spettrale. Per sapere come il colorante entra nelle cellule una volta in soluzione, consultate l'ingresso cellulare tramite riduzione e ripartizione. Per capire come la dose di luce e la geometria influenzino ulteriormente le letture fotochimiche, consultate l'esposizione alla luce e la geometria di misurazione.

La regola da ricordare ha due parti. Lo spettro identifica la miscela presente nella cuvetta nelle condizioni dichiarate. Soltanto una calibrazione costruita nelle stesse condizioni converte un'assorbanza in una concentrazione totale.