Il blu di metilene può aggirare il Complesso III mitocondriale? Perché gli studi discordano

Due laboratori hanno cercato di capire se il blu di metilene possa aggirare un Complesso III mitocondriale bloccato. Uno ha risposto di no. L'altro ha risposto di sì. Entrambi disponevano di dati.

Il primo studio, sui mitocondri cerebrali di topo, ha riscontrato che il colorante non può farlo. Il secondo, sui mitocondri cerebrali di tre specie di roditori, ha riscontrato che può farlo in parte. Un terzo studio, sul fegato di topo, viene spesso citato nello stesso contesto, ma ha verificato qualcosa di diverso. Collocarlo correttamente chiarisce metà della confusione.

Non c'è un meccanismo universale da proclamare. Ci sono tre esperimenti con bloccanti, dosi e misure differenti. Leggete prima le condizioni. Le conclusioni vengono dopo.

Cosa significa bypass in questo contesto

Gli elettroni entrano nella catena attraverso il Complesso I (dal NADH) o il Complesso II (dal succinato), passano attraverso il Complesso III al citocromo c, quindi attraverso il Complesso IV all'ossigeno. Il gradiente creato lungo il percorso è ciò che la cellula utilizza per produrre ATP.

Affermare che esiste un bypass significa sostenere che il blu di metilene raccoglie elettroni a monte di un blocco e li cede a valle. Il colorante ossidato riceve elettroni dal NADH o dai primi componenti della catena, diventando leucometilene blu, e la forma ridotta li trasferisce al citocromo c o li reimmette nella catena. Se il trasferimento avviene a valle del blocco, la respirazione e il potenziale di membrana recuperano parzialmente. Se avviene in corrispondenza del blocco o a monte, non si osserva alcun recupero.

Un dettaglio del Complesso III determina gran parte di questa controversia. Il complesso svolge un ciclo Q con due siti di legame per gli inibitori. L'antimicina si lega al sito Qi. Il mixotiazolo si lega al sito Qo. Uno studio che utilizza soltanto uno dei due ha messo alla prova solo metà del complesso.

Primo studio: nessun bypass nei mitocondri cerebrali di topo

Gureev e colleghi hanno utilizzato mitocondri della corteccia di topi C57BL/6, isolati con digitonina e analizzati a 0.1 mg di proteine per ml. I substrati comprendevano tre condizioni: piruvato più malato a 5 mM ciascuno, succinato a 10 mM con glutammato a 2 mM e L-prolina a 10 mM. I bloccanti erano rotenone a 1 micromolare (Complesso I) e antimicina a 1 microgrammo per ml (Complesso III). Le dosi del colorante erano 0.5, 1 e 2 micromolari, con 1 micromolare come concentrazione principale. Metodi e tracciati sono riportati nella comunicazione su FEBS Letters.

Il bypass del Complesso I ha funzionato. Il rotenone ha ridotto la respirazione stimolata dall'ADP da circa 121 a circa 2 nmol al minuto per mg, e il colorante a 1 micromolare l'ha riportata a circa 21. Il potenziale di membrana è stato recuperato con piruvato più malato e con L-prolina.

Il bypass del Complesso III non ha funzionato. L'antimicina ha ridotto la respirazione a circa 16, e il colorante l'ha portata soltanto a circa 20. Il potenziale di membrana non è stato recuperato con nessun substrato, a dosi di colorante fino a 5 micromolari. I dati sul perossido indicavano la stessa direzione: il solo colorante ha aumentato il rilascio di perossido da un valore basale vicino a 76 pmol al minuto per mg a circa 1170, 1460 e 1945 alle tre dosi, ma l'antimicina ha ridotto questo segnale indotto dal colorante rispettivamente di circa il 25, 88 e 96 percento. Se il colorante ridotto reagisse direttamente con l'ossigeno, il blocco del Complesso III non dovrebbe sopprimere il segnale. Gli autori hanno dedotto che il colorante ridotto viene ossidato al sito Qo del Complesso III, a monte del blocco da antimicina. Il circuito breve, in parole: dai donatori al colorante, dal colorante al sito Qo, poi lungo il percorso normale. Il rotenone viene aggirato. L'antimicina no.

Secondo studio: bypass parziale in tre specie, in entrambi i siti di inibizione

Svab e colleghi hanno ampliato il disegno sperimentale. Hanno utilizzato mitocondri cerebrali di topi, ratti e cavie, isolati con Percoll e analizzati alla stessa concentrazione di 0.1 mg per ml, con piruvato più malato o glutammato più malato a 5 mM ciascuno. Hanno impiegato due bloccanti del Complesso III: antimicina A a 0.3 micromolari e mixotiazolo a 1 micromolare. Il colorante era a 2 micromolari nella maggior parte dei saggi e a 0.5 negli esperimenti sul citocromo c. Tutte e tre le specie, con protocolli uniformi, sono descritte nell'articolo ad accesso aperto.

Entrambi i blocchi sono stati parzialmente aggirati in tutte e tre le specie. Nei mitocondri di topo, l'antimicina ha soppresso la respirazione e il colorante l'ha aumentata di circa il 60 percento, da circa 37 a 59 nmol al minuto per mg. Il mixotiazolo l'ha soppressa dell'88 percento, fino a circa 4.5, e il colorante l'ha quintuplicata, portandola a circa 23. Il potenziale di membrana ha mostrato una ripolarizzazione parziale con entrambi gli inibitori, misurata con due coloranti (safranina O e TMRM raziometrico) per escludere artefatti ottici.

Questo articolo ha anche verificato direttamente il trasferimento, cosa che il primo studio non aveva mai fatto. Il citocromo c acetilato esogeno a 25 micromolari non veniva ridotto dai mitocondri energizzati, con o senza inibitori, ma l'aggiunta del colorante ne induceva la riduzione in entrambi i casi. In un tampone privo di cellule, NADH più colorante riducevano il citocromo c a una velocità proporzionale al NADH. Il salto più lungo, in parole: dagli equivalenti riducenti al colorante, dal colorante direttamente al citocromo c, dal Complesso IV all'ossigeno. Questa via salta interamente il Complesso III, quindi entrambi i bloccanti possono essere aggirati.

Altre due misure sostengono questa interpretazione. La fluorescenza del NAD(P)H diminuiva quando il colorante veniva aggiunto ai mitocondri trattati con mixotiazolo, indicando che gli equivalenti riducenti venivano consumati attraverso la nuova via. Inoltre, l'assorbanza del colorante a 660 nm seguiva ogni aggiunta in sequenza, mentre i surnatanti ottenuti dopo centrifugazione mostravano che il colorante ossidato si concentrava oltre cento volte all'interno dei mitocondri energizzati, per poi uscirne quando il potenziale crollava. Anche il bilancio protonico è coerente: saltare le fasi di pompaggio lascia circa 2 protoni per coppia di elettroni invece di 10, quindi un consumo di ossigeno più rapido con una ripolarizzazione solo parziale è ciò che ci si aspetta da un vero bypass, non una prova contro la sua esistenza.

La stessa preparazione ha prodotto risposte che rendono fuorviante una lettura superficiale. Con inibitore più colorante, l'ADP riduceva la respirazione invece di aumentarla e il blocco del trasporto la stimolava invece di rallentarla, mentre il potenziale di membrana continuava a variare nelle direzioni normali. In questo sistema, il solo consumo di ossigeno può trarre in inganno.

Terzo studio: lo studio sul fegato che ha esaminato i Complessi I e II, non il III

Lee e Boelsterli hanno utilizzato mitocondri epatici di topo ed epatociti in coltura danneggiati da efavirenz (Complesso I, IC50 vicino a 30 micromolari) e idrazina, il metabolita dell'isoniazide (Complesso II, IC50 vicino a 30 micromolari). Il colorante a circa 30 micromolari ha ripristinato l'ossidazione del NADH, il potenziale di membrana e l'ATP, riducendo al contempo gli ossidanti e la morte per necrosi. L'articolo su Redox Biology propone un modello in cui il colorante trasporta elettroni aggirando i Complessi I e II danneggiati.

Questo risultato fornisce un contesto consolidato per ciò che avviene a monte e non dice nulla sul Complesso III, perché in quel punto non era stato bloccato nulla. Non può confermare né confutare nessuno dei due studi sul cervello.

La matrice delle condizioni

Quattro ragioni per cui entrambi gli studi sul Complesso III possono avere ragione nelle rispettive condizioni sperimentali

1. Il blocco non era lo stesso intervento. Antimicina da sola a 1 microgrammo per ml contro antimicina a 0.3 micromolari più un bloccante separato del sito Qo. Una via del colorante che alimenta il sito Qo fallisce esattamente dove una via diretta al citocromo c riesce. Un sito non può rappresentarli entrambi.

2. La dose del colorante e i tempi erano diversi. Concentrazioni principali di 1 contro 2 micromolari, per una sostanza che compie cicli redox e il cui assorbimento e la cui riduzione diretta del citocromo c dipendono dalla concentrazione e dal tempo. Piccole differenze di dose, unite a tempi di misurazione diversi, possono mettere in evidenza rami differenti della stessa rete.

3. Le preparazioni erano diverse. L'isolamento con digitonina e quello su gradiente di Percoll selezionano popolazioni mitocondriali sovrapposte, ma non identiche. La concentrazione proteica era la stessa, 0.1 mg per ml, quindi questa variabile si può escludere, ma non la sottopopolazione e l'integrità. Ed è stato escluso il sospetto che la specie fosse responsabile: il secondo gruppo ha riprodotto il proprio fenotipo anche nel topo.

4. Le condizioni dei substrati determinano cosa può fare il colorante. Tre combinazioni di substrati contro coppie legate al NADH. La disponibilità di NADH e il potenziale di membrana determinano insieme la velocità con cui il colorante viene ridotto e la sua distribuzione, e una via che richiede colorante ridotto accanto a citocromo c ossidato dipende strettamente da questa scelta.

Come valutare la prossima affermazione su un bypass

Chiedete quale complesso è stato bloccato, con quale inibitore, in quale sito e a quale dose. Chiedete la concentrazione del colorante e quando è stata effettuata la misurazione. Chiedete il tessuto, la specie, il metodo di isolamento, la concentrazione proteica e il substrato. E chiedete se potenziale, respirazione, stato redox e un saggio diretto del trasferimento concordano, perché qui il solo consumo di ossigeno ha indicato la direzione sbagliata più di una volta.

La sintesi circoscritta resta valida. Il bypass del Complesso I tramite il colorante è condiviso. Per il Complesso III, i mitocondri di topo con antimicina a 1 microgrammo per ml e colorante a 1 micromolare non mostrano un bypass funzionale, mentre tre specie con antimicina a 0.3 micromolari o mixotiazolo a 1 micromolare e colorante a 2 micromolari mostrano un bypass parziale con trasferimento diretto dal colorante al citocromo c. Queste affermazioni possono coesistere. Qualsiasi conclusione più ampia è un'estrapolazione.

Le letture correlate mantengono l'affermazione controversa entro una chimica non controversa: come il blu di metilene trasferisce gli elettroni per il passaggio degli elettroni, gli esperimenti sul bypass del Complesso I per il caso consolidato a monte, le misure del potenziale di membrana e i loro artefatti per capire perché fossero necessari due coloranti, e la gestione in laboratorio delle sostanze che compiono cicli redox per le insidie legate a dosi e tempi.