Alternative al blu di metilene per microscopia

Per un semplice striscio batterico, il violetto di cristallo può sostituire il blu di metilene quando l'obiettivo è osservare la forma delle cellule. Per le cellule vive, un'alternativa migliore può essere il contrasto di fase senza alcuna colorazione. La scelta dipende dall'osservazione che devi effettuare.

Supponiamo che due persone stiano esaminando la stessa coltura batterica. Una vuole distinguere i bastoncelli dalle cellule rotonde. L'altra vuole sapere se un trattamento ha ucciso i batteri. Una colorazione che fornisce alla prima persona un'immagine chiara potrebbe non fornire alla seconda alcuna risposta utilizzabile.

Prima di scegliere un sostituto, completa questa frase: “Devo osservare ___ in ___, e le cellule devono / non devono rimanere vive.” Questa frase definisce il compito che la colorazione deve svolgere.

Parti dal campione e dalla domanda

Per prima cosa stabilisci se le cellule devono rimanere vive, quindi individua la caratteristica che devi osservare:

Le cellule devono rimanere vive: per il movimento o la forma, considera il contrasto di fase senza colorazione o il DIC; per il DNA nucleare, considera Hoechst 33342 con fluorescenza; per l'integrità della membrana, scegli un saggio validato come SYTO 9 con ioduro di propidio.
Le cellule non devono necessariamente rimanere vive: per la morfologia batterica, considera una colorazione semplice con violetto di cristallo o una colorazione negativa con nigrosina; per la reazione di Gram, usa il metodo completo di colorazione di Gram; per il DNA nucleare in cellule fissate, considera la fluorescenza con DAPI.

Usa questa tabella per confrontare i limiti di ciascuna opzione. Si tratta di scelte metodologiche, non di istruzioni per sostituire un flacone con un altro all'interno di un protocollo esistente.

Cosa devi osservare	Campione e attrezzatura	Alternativa candidata	Limite principale
Forma e disposizione dei batteri	Striscio batterico preparato; campo chiaro	Colorazione semplice con violetto di cristallo	Mostra la morfologia; non determina la reazione di Gram né la vitalità.
Contorni cellulari su sfondo scuro	Preparazione batteriologica; campo chiaro	Colorazione negativa con nigrosina	Preparazione e formulazione sono importanti; una cellula non colorata non è necessariamente viva.
Reazione di Gram	Striscio batterico preparato; campo chiaro	Metodo completo di colorazione di Gram	Richiede la sequenza completa dei reagenti e i controlli.
Movimento o cambiamenti nelle cellule vive	Preparazione a fresco compatibile; contrasto di fase o DIC	Nessuna colorazione	Richiede un'ottica adeguata; il contrasto non identifica una molecola.
DNA nucleare	Cellule fissate; fluorescenza	DAPI	Richiede filtri di eccitazione ed emissione compatibili.
DNA nucleare in cellule vive	Cellule vive; fluorescenza	Hoechst 33342	L'ingresso nella cellula non dimostra che le condizioni di imaging siano innocue.
Integrità della membrana batterica	Batteri non fissati; fluorescenza	SYTO 9 con ioduro di propidio	La colorazione della membrana è una misura indiretta della vitalità.

Per uno striscio semplice, sostituisci il metodo con attenzione

Il violetto di cristallo è un candidato pratico quando il compito consiste nell'ottenere una visualizzazione monocromatica della morfologia batterica. Il Bacteriological Analytical Manual della FDA elenca due formulazioni di violetto di cristallo adatte alla colorazione semplice. Usa una formulazione documentata e il relativo metodo di preparazione; il solo nome del colorante non definisce un reagente pronto all'uso.

Il violetto di cristallo viene utilizzato anche nella colorazione di Gram, ma questo non rende una colorazione semplice con violetto di cristallo una colorazione di Gram. Nel protocollo ASM per la colorazione di Gram, il risultato differenziale dipende dall'azione sequenziale di violetto di cristallo, iodio, decolorazione e controcolorazione. Omettere questi passaggi modifica ciò che l'immagine può dimostrare. Consulta colorazione semplice rispetto alla colorazione di Gram per questa distinzione.

La nigrosina offre un modo diverso per evidenziare i contorni: scurisce lo sfondo mentre le cellule batteriche rimangono relativamente chiare. Nelle istruzioni Merck per la nigrosina è presente un dettaglio utile che un elenco generico di sostituti potrebbe tralasciare. La formulazione di lavoro specificata contiene formaldeide. Non puoi quindi dedurre la compatibilità con cellule vive dalle parole “colorazione negativa”, anche se le cellule stesse appaiono non colorate. Verifica la formulazione completa e la preparazione del campione.

Per i campioni vivi, considera di cambiare l'ottica

Se vuoi osservare le cellule mentre si muovono o si dividono, introdurre un altro colorante può complicare l'osservazione. Come spiega Nikon nella sua guida sul contrasto nei campioni trasparenti, il contrasto di fase e il contrasto interferenziale differenziale, o DIC, rendono visibili i campioni attraverso differenze nelle loro proprietà ottiche. Possono mostrare cellule vive e non colorate, purché il microscopio disponga dei componenti necessari.

Questa scelta mantiene una preparazione non colorata, ma modifica le informazioni disponibili. Puoi seguire un contorno o un movimento senza sapere quale molecola abbia prodotto il contrasto. Se la domanda riguarda la localizzazione molecolare, scegli invece un metodo di marcatura appropriato.

Per il DNA nucleare, il confronto di Invitrogen tra le colorazioni DAPI e Hoechst distingue l'uso comune del DAPI con cellule fissate da Hoechst 33342, maggiormente permeabile alle cellule e preferito per la marcatura di cellule vive. Entrambi richiedono apparecchiature per fluorescenza. Nessuno dei due è un sostituto diretto di una colorazione cromatica in campo chiaro.

Considera l'esposizione al colorante e l'illuminazione come condizioni sperimentali. Confronta preparazioni colorate e non colorate quando il comportamento delle cellule costituisce la tua misura.

Una cellula rossa non è automaticamente una cellula morta

SYTO 9 e ioduro di propidio vengono spesso utilizzati insieme per valutare l'integrità della membrana batterica. Il manuale BacLight associa le membrane integre alla colorazione verde e le membrane danneggiate alla colorazione rossa. Questa interpretazione deve essere validata per il campione specifico.

Uno studio del 2019 di Rosenberg e colleghi illustra il problema. Nei biofilm di E. coli di 24 ore su vetro in soluzione salina tamponata con fosfato, circa il 96% delle cellule appariva positivo allo ioduro di propidio in situ. Tuttavia, gli autori hanno stimato che l'82% fosse coltivabile dopo la raccolta. Le immagini confocali mostravano cellule con interni verdi sotto materiale colorato di rosso, indicando gli acidi nucleici extracellulari come causa del segnale fuorviante.

Queste percentuali descrivono misurazioni diverse effettuate sulle preparazioni dello studio, non un fattore di correzione universale. La lezione utile è verificare che cosa abbia generato il segnale. In un biofilm, un colorante per acidi nucleici può rilevare materiale all'esterno delle cellule oltre che all'interno delle cellule danneggiate. Per una conclusione sulla vitalità, i ricercatori raccomandano misurazioni complementari, come la coltivazione o l'attività metabolica, riconoscendo che ciascuna presenta dei limiti.

Verifica cosa contiene realmente l'alternativa

Un metodo di colorazione alternativo può comunque contenere blu di metilene. Giemsa ne è un esempio: Merck descrive il proprio prodotto come una soluzione di Azure B-eosina-blu di metilene, destinata ad applicazioni che includono strisci di sangue e midollo osseo. Può essere un metodo diverso per un campione diverso, ma non soddisfa il requisito di escludere il blu di metilene.

Se l'esclusione di un composto fa parte dell'esperimento, verifica l'identità e la formulazione del reagente prima di confrontare le immagini. La guida su blu di metile, blu di metilene e coloranti con nomi simili tratta le differenze di denominazione.

Verifica la sostituzione prima di utilizzare il risultato

Per un nuovo metodo, esegui un piccolo confronto utilizzando campioni rappresentativi e un controllo appropriato. Mantieni comparabili le impostazioni del microscopio ove possibile. Registra la formulazione del reagente, la preparazione del campione, l'esposizione e le condizioni di imaging, in modo che un'immagine dall'aspetto migliore possa essere analizzata anziché semplicemente preferita.

Valuta il successo rispetto alla domanda originale. Per la morfologia, verifica se i contorni e la disposizione delle cellule rimangono interpretabili. Per la marcatura nucleare, valuta la localizzazione del segnale e lo sfondo. Per la vitalità, richiedi evidenze che vadano oltre una separazione cromatica visivamente convincente. La guida più ampia sulla colorazione con blu di metilene e le applicazioni di laboratorio spiega come l'osservazione e la preparazione si integrano tra loro.

Scegli l'alternativa che conserva la misura di cui hai bisogno. Il colore è solo una delle proprietà dell'immagine risultante.