Saga metýlenblás: frá litarefni til lyfs og rannsókna

Metýlenblátt náði til sjúklings áður en það náði í apótek.

Í skýrslu Paul Guttmann og Paul Ehrlich frá 1891 um notkun litarefnisins við malaríu eru tvö hitastigsrit. Hið síðara nær frá 13. júlí til 5. ágúst og meðferðin er skráð við jaðarinn dag fyrir dag. Færslurnar 18. og 19. júlí segja „1 × 0,05 Methylenblau“. Næstu daga eru skráðir fimm og sjö skammtar af sama magni og 22. júlí hefur lítið magn af kíníni bæst við skráninguna. Hitalínan, sem sveiflast milli 37 °C og 39.5 °C fyrri helming ritsins, jafnast út eftir að litarefnið kemur til sögunnar og helst milli um 36 °C og 37.5 °C þær þrjár vikur sem eftir eru.

Sjúklingurinn var annar tveggja sem lýst var í greininni sem heimilisþjóni og sjómanni. Efnið sem þeir fengu hafði verið textíllitarefni á markaði í fimmtán ár og mennirnir tveir eru meðal fyrstu einstaklinga sem skráðir eru sem meðhöndlaðir með fullkomlega tilbúnu lyfi sem beindist að tiltekinni lífveru.

Litarefnið kom fyrst

Fyrsta tilbúna litarefnið sem náði viðskiptalegum árangri var búið til af William Henry Perkin árið 1856. Perkin var átján ára, vann á heimarannsóknarstofu í páskafríi og reyndi að framleiða kínín. Í staðinn fékk hann svarta leif, leysti hana upp og fann lit sem festist einstaklega vel við silki. Hann fékk einkaleyfi á honum í ágúst 1856 og hafði verksmiðju sem útvegaði silkilitunarverksmiðju í London efnið fyrir lok árs 1857.

Árið 1875 framleiddi Adolf von Baeyer rautt litarefni og nefndi það eosin, eftir Eos, gríska orðinu fyrir dögun. Árið 1876 þróaði Heinrich Caro, þáverandi forstöðumaður rannsóknarstofunnar hjá Badische Anilin- und Soda-Fabrik, metýlenblátt ásamt Baeyer sem anilínbyggt litarefni fyrir bómull. Efnafræðileg bygging þess var ekki endanlega ákvörðuð fyrr en um níu árum síðar.

Þessi uppruni sést enn í nafngift efnisins. „Methylene blue“ er vöruheiti úr litarefnaskrá, ekki efnafræðileg lýsing. Efnið sem nafnið vísar til er methylthioninium chloride og munurinn á heitinu, saltinu og hýdrötum þess skiptir máli um leið og einhver vegur efnið eða les forskrift.

Litun varð brúin

Leiðin frá litunarverksmiðjunni til sjúkrahússins lá um smásjána og hófst áður en metýlenblátt var til. Wilhelm Erb var fyrstur til að nota tilbúið litarefni á blóð, með píkrínsýru árið 1865, og sá netlaga mynstur inni í sumum rauðum blóðkornum.

Doktorsritgerð Paul Ehrlich frá 1878 bar saman vefjalitun og litun textíls og hélt því fram að hvort tveggja væri efnahvarf. Þegar hann starfaði undir stjórn Robert Koch við berklabakteríuna flokkaði hann anilínlitarefni í súr og basísk efni og sýndi fram á að hvor flokkur litaði mismunandi hluta frumu. Árið 1880 blandaði hann þeim saman: mettuðum metýlenbláum lausnum var hellt út í súrt fúksín þar til yfirvökvinn varð tær. Niðurstaðan, sem hann kallaði neutralen Farbkörper eða hlutlausa litun, gaf þrjá liti í stað eins, sýndi korn í fjölkjarnafrumum sem áður höfðu ekki sést og gerði fyrstu mismunatalningu hvítkorna mögulega. Þar sem þessi korn tóku upp báða þætti blöndunnar bjó Ehrlich til orðið neutrophil yfir frumurnar sem báru þau.

Tveimur árum síðar notaði Koch metýlenblátt til að finna berklabakteríuna og árið 1883 bætti Ehrlich aðferðina. Árið 1886 birti hann annars konar athugun: hann sprautaði litarefninu í lifandi dýr, bar saman hversu sterkt hvert líffæri tók það upp og komst að þeirri niðurstöðu að það hefði áberandi sækni í heila- og taugavef. Hann rakti þessa sækni til oxunar-afoxunarhringrásar litarefnisins, sem hann hafði fylgst með árið áður. Þessi hringrás skýrir einnig hvers vegna metýlenblá lausn missir lit sinn þegar súrefni hennar er uppurið og fær hann aftur þegar loft kemst að. Tilraunirnar sem fyrst mældu afleiðingar þessarar hringrásar tilheyra síðara áratugi og sjálft ferlið er annað viðfangsefni en sagan.

Sníkjudýrið og fjólublái kjarninn

Alphonse Laveran fann malaríusníkjudýrið árið 1880 með því að skoða ferskt, ólitað blóð. Til að sjá það reglulega í þurrkuðu blóðstroki þurfti litun og litunaraðferðir þess tíma gáfu aðeins rauðan og bláan lit.

Árið 1888 skipti pólski meinafræðingurinn Czesław Cheçinski súru fúksíni út fyrir eosin og útbjó blöndu af metýlenbláu og eosin. Tilvikið að baki aðferð hans var hermaður sem lést úr malaríu 30. september 1887. Í blóðstrokunum sá Cheçinski bláar, baldursbrárlaga myndanir, sem nú eru þekktar sem Plasmodium malariae, og sigðlaga myndanir, sem nú eru þekktar sem kynfrumur Plasmodium falciparum. Niðurstaðan batt enda á tvær samkeppnisskýringar á sjúkdómnum í einu: míasmakenninguna og þá fullyrðingu Edwin Klebs og Corrado Tommasi-Crudeli að malaría stafaði af bakteríu.

Sníkjudýrið var sýnilegt. Kjarni þess var það ekki, sem lét eðli þess óljóst. Ernst Malachowski, læknir í Breslau, leysti vandann fyrst fyrir tilviljun og síðan með ásetningi. Hann tók eftir mismunalitun á kjarna plasmodíums í sýni árið 1889 en gat ekki endurtekið hana. Það hjálpaði ekki að gera metýlenbláa lausnina súrari. Þegar hún var gerð basískari með boraxi komu áhrifin fram í hvert skipti. Hann sýndi aðferðina opinberlega 15. júní 1890 og birti hana sama ár, með ítarlegri aðferð í ágúst 1891.

Dmitri Romanowsky birti sína eigin útgáfu í september 1891. Besti árangur hans kom úr vanræktri, myglaðri flösku af metýlenblárri lausn sem var meira en tveggja mánaða gömul. Lýsing Malachowski var meðvituð og, að hans sögn, auðveld í endurtekningu; aðferð Romanowsky var blindgata sem virkaði einu sinni. Samt var aðferðin kennd við Romanowsky og deilan um hver framleiddi fjólubláa litinn sem gerði kjarnann sýnilegan er sérstök saga með eigin heimildum.

Mynd: annað hitastigsritið úr skýrslu Guttmann og Ehrlich frá 1891. Efri hlutinn nær frá 13. til 24. júlí og neðri hlutinn frá 25. júlí til 5. ágúst; færslurnar við jaðarinn tilgreina skammtana sem voru gefnir og hitastigið helst nálægt eðlilegum mörkum síðustu þrjár vikur skráningarinnar. Endurbirt úr skýrslunni eins og hún var skönnuð fyrir Krafts, Hempelmann og Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

„Þroskun“ reyndist vera afmetýlering

Enginn sem kom að málinu á 10. áratug 19. aldar vissi hvað „þroskun“ gerði við metýlenblátt. Svarið kom úr iðnaðarefnafræði. Heinrich August Bernthsen hafði framleitt móðurefnið phenothiazine árið 1883, staðfest árið 1885 að metýlenblátt tilheyrði þeim efnaflokki og sýnt á sama tímabili að basískar aðstæður fjarlægja metýlhópa af litarefninu og mynda efnin sem nú eru kölluð azure-litarefni.

Bernard Nocht einangraði virka hlutann árin 1898 og 1899 og gat aðeins kallað hann Rot aus Methylenblau, rautt úr metýlenbláu. Michaelis auðkenndi hann sem azure I árið 1901. Jenner innleiddi hreint metanól sem leysi fyrir litarefnaútfellinguna árið 1899, sem gerði hitafestingu blóðstroka óþarfa; Leishman og Reuter sameinuðu báðar framfarirnar; Wright birti einfaldaða aðferð árið 1902. Framlag Giemsa, einnig árið 1902, var að hætta að treysta á lausn sem hafði „þroskast“ af handahófi og nota í staðinn mælt magn þekktra litarefna. Hann neitaði síðan að birta hvernig hann framleiddi hreint methylene azure og seldi aðferðina rannsóknarstofu Dr. Grübler, sem markaðssetti efnið sem azure I og hélt því fram að aðeins hennar útgáfa væri ósvikin Giemsa-litun.

Tvær heimsstyrjaldir luku verkinu fyrir tilviljun. Þegar ekki var lengur hægt að fá þýsk litarefni unnu Lillie, Roe og Wilcox með bandarísk staðgönguefni og komust að því að besta litunin fékkst með þremur aðskildum efnisþáttum: hreinu metýlenbláu, niðurbrotsefni þess azure B og eosin. Þessi þrjú efni eru enn helstu þættir litunarinnar sem notuð er til greiningar á malaríu í dag, undir heiti sem nú tengir Malachowski, Wright og Giemsa saman.

Mynd: hringform Plasmodium falciparum í rauðum blóðkornum manna, lituð með aðferð af Romanowsky-gerð. Fjólubláa byggingin inni í hringnum er litnið sem metýlenblátt meðhöndlað með boraxi samkvæmt aðferð Malachowski gerði sýnilegt í fyrsta sinn. Mynd eftir Ernst Hempelmann, gefin út í almenningseign.

Eitt heiti, nokkur efni

Árin sem liðu þar til þessir efnisþættir voru aðskildir skildu eftir vandamál sem lifði efnafræðina af. Ralph Lillie dró mörkin árið 1969 milli líffræðilegra litarefna, „framleiddra samkvæmt ströngum forskriftum sem samsvara viðkvæmri og nákvæmri notkun þeirra“, og ólíffræðilegra litarefna til textíllitunar, sem „krefjast ekki jafn strangra og krefjandi framleiðslustaðla“. Báðar vörutegundir báru sama heiti og munurinn á þeim var aldrei aðeins stigsmunur. Forskrift sem samin er fyrir bómull og forskrift sem samin er fyrir greiningarhvarfefni eru ekki skiptanlegar og efni framleitt samkvæmt textílforskriftinni var ekki ætlað til inntöku.

Azure B er skýrasta dæmið. Það er ein-afmetýlerað form metýlenblás, hefur mælanlega lyfjafræðilega virkni sjálft og var til staðar sem óstýrður efnisþáttur í klínískum metýlenbláum efnablöndum í meira en öld áður en nokkur aðskildi efnin tvö. Einn rannsóknarhópur komst að því að mannavefur sem tekinn var við krufningu eftir gjöf metýlenblás innihélt 5 til 14 prósent óbreytt metýlenblátt og 86 til 95 prósent azure B. Hvort tiltekin efnablanda eigi að innihalda azure B og við hvaða mörk er spurning um forskrift og rannsóknir á azure B sem óhreinindum og umbrotsefni halda áfram þaðan.

Forskriftin er einnig þar sem hagnýta afleiðingin liggur. Samræmi við USP er leiðin að mesta hreinleika sem markaðurinn býður, vegna þess að það er fullbúinn, birtur prófunarstaðall fremur en ein stök mæling. Hann nær yfir auðkenningu, styrkleikagreiningu, lífræn óhreinindi, þar á meðal azure-litarefnin, leifar leysiefna, frumefnaóhreinindi, leifar eftir glæðingu, örverumörk og bakteríuendótoxín. Vottorð sem greinir frá niðurstöðu fyrir þungmálma og kallar það USP-samræmi hefur aðeins greint frá einni línu af þessum lista.

Blupreme fær metýlenblátt sitt frá lyfjaframleiðanda og birtir fullt greiningarvottorð þar sem öll USP-forskriftin er prófuð, ekki aðeins þungmálmar. Leiðbeiningarnar um hvernig lesa á greiningarvottorð og hvað USP-merkingin staðfestir og staðfestir ekki útskýra hvernig bera á skjalið saman við fullyrðinguna.

Hvað sagan heimilar að álykta og hvað ekki

Sögulega þróunin er raunveruleg og lengri en flestar vörusíður gefa til kynna. Metýlenblátt var notað við malaríu árið 1891, greint var frá því sem róandi efni við órólegu geðrofi árið 1899 og hliðarkeðja þess liggur í gegnum quinacrine, chloroquine, promethazine og chlorpromazine. Grein Ehrlich frá 1890 með Arthur Leppmann lýsti minnkun taugaverkja og gigtarverkja og fjallaði síðan um, en ákvað að prófa ekki, litarefnið við geðsjúkdómum.

Ekkert af þessu staðfestir nútímanotkun. Niðurstaðan um malaríu árið 1891 byggðist á tveimur sjúklingum og hitastigsriti. Löng reynsla af sameind er ástæða til að rannsaka hana, ekki niðurstaða. Saga efnisins sem lyfs og nútímarannsóknir á malaríu svara öðrum spurningum en þeim sem Ehrlich var að spyrja og meta verður endapunktana á eigin forsendum.

Eitt atriði í heimildunum tilheyrir nútímanum fremur en fortíðinni. Þegar vísindamenn framkvæmdu rannsóknir á metýlenbláu við malaríu í Burkina Faso á fyrsta áratug 21. aldar þurftu þeir að keppa um efni í lyfjagæðum og greindu frá því að verð hráefnisins hefði hækkað um um það bil hundraðfalt þegar það fékk GMP-staðfestingu. Hægt var að skipta út litarefni. Ekki lyfi. Aðgreiningin sem Lillie dró árið 1969 er sú sama og ræður því hvað flaska inniheldur í dag.