Tilraunirnar sem tengdu metýlenblátt við frumuöndun

Mannsblóð sem fíbrín hefur verið fjarlægt úr og er haldið við 37 °C í þrjár klukkustundir notar um tvö prósent af súrefninu sem það inniheldur. Sé litlu magni af metýlenbláu bætt við fyrir ræktunina notar sama blóð um sextíu og fimm prósent. Ekkert breyttist í frumunum. Aðeins lausnin breyttist.

Þessi tala kemur úr grein sem George Harrop og E. S. Guzman Barron við Johns Hopkins birtu árið 1928 og er upphaf þeirrar fullyrðingar, sem oft er endurtekin, að metýlenblátt bæti frumuöndun. Fullyrðingin er ekki röng en hún hefur þrengri merkingu en virðist í fyrstu.

Hvað talan í töflunni mælir í raun

Mælibreytan var súrefnisupptaka, ákvörðuð með gasgreiningu. Harrop og Barron síuðu nýtekið blóð í gegnum bómull við 10 °C til að fjarlægja hvítkorn, mettuðu sýnið með súrefni, skiptu því, bættu litarefni í annan hlutann og greindu báða eftir ræktun. Fjöldi hvítkorna fór sjaldan yfir um þúsund í rúmmillimetra. Súrefnisnotkun var gefin upp sem sá hluti upphaflegs súrefnisinnihalds sýnisins sem hafði horfið.

Þeir mældu einnig koltvísýring en þar setti aðferðin þeim skorður. Blóð sem fíbrín hafði verið fjarlægt úr losaði allt að tveimur millimólum af koltvísýringi á hverja 100 mL á fyrstu klukkustund ræktunarinnar af ástæðum sem tengdust ekki hvarfinu sem verið var að rannsaka. Öndunarhlutföll úr heilblóði voru því ónothæf. Aðeins þvegnar frumur í Locke-lausn gáfu túlkanleg gildi og þau lágu á bilinu 0.73 til 0.80, bæði með og án litarefnisins.

Þetta atriði er ekki aukaatriði. „Öndun“ í þessum greinum merkir gasskipti í lokuðu íláti. Bilið milli súrefnisnotkunar og nýtanlegrar orkuframleiðslu er skoðað sérstaklega í greininni um hvað súrefnisnotkun segir og segir ekki um ATP.

Litarefnið hafði mest áhrif þar sem frumurnar önduðu minnst

Þroskuð rauðkorn spendýra hafa nánast enga mælanlega súrefnisnotkun. Rauðkorn fugla, sem hafa kjarna, nota hins vegar súrefni. Harrop og Barron prófuðu hvort tveggja og þessi munur er kjarninn í röksemdafærslu þeirra.

Í sýnum úr spendýrum olli litarefnið tuttugu- til fimmtíufaldri aukningu. Í gæsablóði, þar sem frumurnar önduðu þegar, jók það hraðann aldrei meira en tvöfalt. Því meiri sem öndunin var í upphafi, því minna gat litarefnið bætt við.

Sama mynstur kemur fram innan einnar tegundar. Mannsblóðsýni úr sjúklingi með frumkomna rauðkornadreyri, sem innihélt óþroskaðar frumur, notaði 11.3 prósent af súrefni sínu án litarefnis, samanborið við 2.8 prósent hjá þvegnum frumum úr heilbrigðum gjafa. Litarefnið jók notkunina aðeins í 63.4 prósent, sexfalda aukningu, á meðan aukningin hjá eðlilegum frumum var nær þrítugföld. Litarefnið færði starfsemi þroskaðra frumna nær starfsemi óþroskaðra frumna, og þannig lýstu höfundarnir áhrifum þess.

Sýaníð hefði átt að stöðva þetta

Vitað var að sýaníð stöðvaði oxun í frumum. Harrop og Barron bættu því engu að síður við ásamt litarefninu.

Niðurstöðurnar úr nautgripablóði eru dæmigerðar. Súrefnisinnihaldið lækkaði úr 22.61 í 22.03 rúmmálsprósent á þremur klukkustundum án íblöndunar. Með metýlenbláu lækkaði það í 12.84. Með metýlenbláu og kalíumsýaníði í styrknum einn fimmþúsundasti úr móli á lítra lækkaði það í 12.74. Áhrif litarefnisins voru nánast óbreytt.

Mynd: samfelld skráning á öröndun rauðkorna úr mönnum. Örin sýnir hvenær metýlenbláu var bætt við. Fyrir það er línan nær lárétt; eftir það hækkar hún jafnt og þétt. Endurbirt úr Harrop og Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Niðurstaða þeirra var að litarefnið virkaði sem súrefnisberi og „legði til efni sem er horfið úr kjarnalausum rauðkornum fullorðinna spendýra“. Tveimur árum síðar settu Michaelis og Salomon við Rockefeller-stofnunina ágreininginn fram í þeirri mynd sem hann hefur haldið síðan. Annaðhvort væru áhrif litarefnisins „tilviljanakenndur eiginleiki litarefnisins“ eða litarefnið væri „líkan af einhverju óþekktu efni í lífverunum“. Ekki hefur verið skorið úr um þessa tvo möguleika. Það sem hefur breyst er að nú er hægt að lýsa frumunum mun nákvæmar.

Útdráttur úr lifur gerði það sama

Michaelis og Salomon sýndu að útdrættir úr líffærum, unnir með köldu vatni, valda sömu örvun. Rottulifur hafði mest áhrif, síðan nýru, milta og eistu. Heili, vöðvar og blóðsermi höfðu lítil eða engin áhrif.

Þeir prófuðu síðan útdráttinn í viðurvist kolmónoxíðs. Öndun sem annaðhvort útdrátturinn eða litarefnið framkallaði var óbreytt í blöndu af 98 prósent kolmónoxíði og 2 prósent súrefni. Sama gasblanda hamlaði öndun gers og kjarnaberandi rauðkorna hænsna um u.þ.b. 60 til 80 prósent, í samræmi við lýsingu Warburgs á öndunarensími sem er næmt fyrir kolmónoxíði. Hið óþekkta efni í vefjunum var því ekki ensím Warburgs.

Nokkur efni sem komu til greina voru útilokuð á leiðinni. Afoxað glútaþíon og systein ollu aðeins þeirri súrefnisnotkun sem þurfti til að oxa þau sjálf. Kóensím Hardens og Youngs var útilokað vegna þess að mest er af því í vöðvum, þar sem áhrifin voru með þeim minnstu. Sýtókróm Keilins, sem hafði fengið nafn sitt nokkrum árum áður, rakst á sömu mótsögn. Þeir kölluðu eigin tillögu, um að virka efnið kæmi úr frumukjarnanum, aðeins tilgátu.

Áhrifin voru háð ákveðnum skilyrðum

Frumurnar þurftu að vera heilar. Blóðrof af völdum eimaðs vatns eða endurtekinnar frystingar afnam viðbrögðin við bæði litarefninu og útdrættinum, og blóðrof að hluta dró úr þeim í sama hlutfalli.

Sykur var einnig nauðsynlegur. Glúkósi, frúktósi og súkrósi studdu við öndunina sem litarefnið framkallaði; mannitól gerði það ekki. Án sykurs var engin öndun og litarefnið virtist skaða frumurnar á meðan. Glúkósi sem var bætt við einni eða tveimur klukkustundum síðar endurheimti hana því ekki. Höfundarnir lögðu til að litarefnið væri að oxa byggingarþátt sem fruman þyrfti á að halda.

Lýsing jók áhrif litarefnisins verulega, þótt áhrifin væru greinileg í myrkri. Önnur litarefni sem hægt er að afoxa hegðuðu sér öðruvísi: tólúýlenblátt hafði jafnmikil eða meiri áhrif en metýlenblátt, en indígódísúlfónat gerði nánast ekkert. Engin skýr tengsl komu fram milli oxunar-afoxunarmættis litarefnis og umfangs áhrifa þess, sem höfundarnir töldu stafa af gegndræpi frumuhimna og eituráhrifum.

Áhrifin fylgdu gerjun, ekki öndun

Rannsókn Barrons frá 1930 færði viðfangsefnið frá frumusviflausnum yfir í vefjasneiðar úr eðlilegum líffærum rotta og ígræddum æxlum.

Í vefjum án loftháðrar glýkólýsu hafði metýlenblátt engin áhrif eða dró lítillega úr súrefnisnotkun: í nýrum um um það bil 14 prósent, í brisi um um það bil 14 prósent og í lifur um um það bil 5 prósent. Í vefjum sem gerja í nærveru súrefnis jók það notkunina: í milta um um það bil 8 prósent og í heila um um það bil 13 prósent. Aukningin í æxlum var frá um 27 prósentum í brjóstakrabbameinsæxli úr manni upp í meira en 80 prósent í Rous-sarkmeini úr hænsnum, nokkurn veginn í hlutfalli við loftháða glýkólýsu hvers vefs.

Mynd: hver punktur er ein vefjagerð. Lárétti ásinn sýnir loftháða glýkólýsu; lóðrétti ásinn sýnir breytingu á súrefnisnotkun eftir að metýlenbláu var bætt við. Gögn úr Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), töflu 6, PMID 19869777.

Sýaníðtilraunin gaf síðan spegilmyndina. Þegar öndun í þessum vefjum, sem höfðu áður ekki brugðist við, var stöðvuð með sýaníði og gerjun kom fram jók litarefnið súrefnisnotkun á ný: í nýrum um um það bil 59 prósent, í lifur um um það bil 19 prósent, í milta um um það bil 286 prósent og í eistum um um það bil 200 prósent.

Barron lagði til að litarefnið gæti nýst sem próf á gerjunargetu frumu eða vefs og lauk greininni með vangaveltu: margar kynslóðir æxlisfrumna í ræktunaræti sem innihéldi litarefnið gætu hugsanlega einn daginn gert efnaskipti æxlis varanlega lík efnaskiptum eðlilegs vefs. Þetta var rannsóknarspurning sem var sett fram árið 1930. Hún er ekki fullyrðing um meðferð.

Hvað tilraunirnar gátu ekki hafa mælt

Árin 1928 og 1930 merkti „öndun“ súrefnisnotkun. Fyrst var greint frá adenósínþrífosfati árið 1929 og árið 1949 var sýnt fram á að einangraðir hvatberar esterbinda fosfat samhliða rafeindaflutningi. Engin af fyrstu greinunum um metýlenblátt gat hafa mælt orkuframleiðslu og engin þeirra sagðist gera það.

Frumurnar eru annað vandamál. Þroskuð rauðkorn spendýra innihalda enga hvatbera. Á netfrumustiginu fjarlægja þau hvatbera og ríbósóm með sértæku sjálfsáti. Þess vegna byggir starfsemi þroskaðs rauðkorns á glýkólýsu og það reiðir sig á pentósafosfatferilinn fyrst og fremst fyrir NADPH fremur en ATP. Í tilraununum frá 1928 var engin rafeindaflutningskeðja til staðar sem hægt var að lagfæra. Það sem notaði súrefnið var að gera eitthvað annað.

Nú er allvel lýst hvað þetta annað var. Metýlenblátt tekur við rafeindum frá afoxandi efnum í frumunni og verður að leúkómetýlenbláu, sem er aftur oxað af sameindasúrefni og lokar þannig hringrásinni. Í rauðkornum manna sjá NADPH-háður flavínafoxari og skyldir dísúlfíð-afoxarar um afoxunarskrefið. Rannsókn frá 1976 þar sem notaður var merktur glúkósi sýndi að litarefnið örvar hexósamónófosfatleiðina, að áhrifin við lágan styrk voru háð oxýhemóglóbíni og að hærri styrkur, 0.1 mM, myndaði vetnisperoxíð. Afoxað litarefni sem kemst í snertingu við súrefni myndar peroxíð, ekki fosfattengi.

Í hvatberum er myndin umdeildari en vinsælar samantektir láta í ljós. Ein rannsóknarlína heldur því fram að litarefnið taki við rafeindum frá svæðinu við komplex I og afhendi þær sýtókrómi c. Önnur sýndi að í hvatberum úr músarheila getur það ekki endurheimt öndun eftir hömlun með antímýsíni og staðsetti rafeindaþegann þess í stað við úbíkínólbindiset komplex III. Sú þriðja sýndi að lágur styrkur jók súrefnisnotkun í hvíld án þess að breyta ADP-örvaðri öndun. Skýrasta framsetning þessa atriðis er að súrefnisnotkun sem metýlenblátt framkallar er alls ekki háð oxandi fosfórun: hún hélt áfram þegar öndunarkeðjan var hömluð og í sýnum sem höfðu enga slíka keðju.

Beinar mælingar á bilinu milli þessara tveggja stærða liggja einnig fyrir. Í einangruðum hvatberum úr rottulifur lækkaði hlutfall öndunar með og án ADP eftir því sem styrkur litarefnisins jókst og hvatberarnir þrútnuðu, sem höfundarnir lýstu sem aftengingu oxandi fosfórunar. Í rottulifur sem var gegnumflædd jók metýlenblátt súrefnisnotkun á meðan hlutfall ATP á móti ADP lækkaði.

Klínískar heimildir bera sama boðskap. Methemóglóbíndreyri er meðhöndluð með um einu til tveimur milligrömmum af metýlenbláu á hvert kílógramm í bláæð, með NADPH-háðum afoxunarferli, en stærri skammtar valda ástandinu sem verið er að meðhöndla. Í sömu yfirlitsgrein kemur fram að áhrifin sem mótefni eru mest í heilum rauðkornum og minnka þegar blóðrof er til staðar. Þar birtist niðurstaðan um blóðrof frá 1930 aftur, sjötíu og þremur árum síðar, í klínísku samhengi. Ekki ætti að álykta um skammt af súrefnisnotkunarmælingu þegar gagnleg og skaðleg áhrif efnis liggja sitt hvorum megin við ákveðin skammtamörk.

Hvers vegna framleiðslulotan á heima í umræðunni

Harrop og Barron tóku eftir atriði sem er þess virði að lesa aftur. Metýlenblátt sjálft myndar band í litrófssjá milli tveggja einkennandi banda methemóglóbíns, „sem getur auðveldlega valdið ruglingi við lauslega skoðun“. Litarefnið getur líkt eftir efninu sem verið er að leita að.

Sama vandamál á sér efnafræðilega hlið. Skylt fenóþíasín sem er til staðar í litlu magni hefur sína eigin oxunar-afoxunarhegðun, sitt eigið gegndræpi og sín eigin eituráhrif. Eitt skjalfest dæmi sýnir þetta skýrt: í rannsókn á joðun metýlenblás mynduðu sýni sem innihéldu um 7 til 8 prósent Azure B aðallega joðað Azure B. Það var því óhreinindið, fremur en metýlenblátt, sem réð mestu um hvarfið.

Allir sem nota metýlenblátt sem hvarfefni, á rannsóknarstofu, við litunarvinnu eða í fiskabúri, eru að vinna með efni með óskilgreinda samsetningu nema framleiðslulotan hafi verið greind. Skyld efni, auðkenning, óhreinindi af völdum frumefna, leifar leysiefna og glæðileifar eru hluti af tilrauninni, ekki bara pappírsvinna í kringum hana. Blupreme fær metýlenblátt frá lyfjaframleiðanda og birtir fullt greiningarvottorð þar sem prófað er samkvæmt öllum kröfum USP, ekki aðeins fyrir þungmálmum. Leiðbeiningarnar um lestur greiningarvottorðs og greinin um hvað merkingin USP-gæði staðfestir og staðfestir ekki fjalla um hvernig bera má skjalið saman við fullyrðinguna.

Talan var rétt

Tilraunirnar frá 1928 og 1930 voru vandlega unnar og meginniðurstaða þeirra hefur staðist: litarefni sem hægt er að afoxa getur fengið frumu sem andar varla til að nota margfalt meira súrefni en í hvíld, án þess að fara í gegnum skrefið sem sýaníð stöðvar.

Mistökin verða síðar, þegar „öndun“ er lesin í nútímamerkingu orðsins. Mæling á gasskiptum segir að rafeindir hafi borist til súrefnis. Hún segir ekki að einhverjar þeirra hafi verið notaðar til að mynda ATP og í frumu án hvatbera er bilið milli þessara tveggja fullyrðinga eins breitt og það getur orðið. Heildaryfirlitið yfir það sem metýlenblátt gerir í frumum setur sama greinarmun í víðara samhengi og saga efnisins frá litarefni til lyfs skýrir hvernig textíllitarefni rataði yfirhöfuð í þessar tilraunir.