Paul Ehrlich dan metilen biru: bagaimana pewarna membantu membentuk penemuan obat

Kontribusi Paul Ehrlich terhadap kedokteran bukanlah sebuah obat. Kontribusinya adalah sebuah argumen tentang bagaimana cara melihat sebuah obat.

Pada tahun 1878 ia mengajukan tesis doktoral yang bagian pembukanya berjudul "The Chemical Conception of Staining." Argumennya adalah bahwa mewarnai potongan jaringan dan mewarnai sepotong kain mengikuti logika yang sama. Dalam keduanya, warna melekat karena adanya afinitas kimia antara pewarna dan materialnya, bukan karena jaringan bersifat menyerap, berminyak, atau memiliki bentuk yang menjebak pigmen. Ehrlich tumbuh dengan melihat sepupunya, ahli patologi Karl Weigert, menyiapkan potongan jaringan berwarna, dan yang menarik perhatiannya bukanlah gambarnya, melainkan fakta bahwa pewarna memilih ke mana ia pergi.

Klaim tersebut terdengar sederhana. Namun tidak demikian. Jika sebuah pewarna berikatan dengan jaringan karena alasan kimia, maka pola pewarnaan adalah laporan tentang kimia jaringan tersebut. Preparat berwarna berhenti menjadi ilustrasi dan menjadi sebuah pengukuran.

Ia segera mengembangkan gagasan tersebut. Pada tahun 1880 ia menggabungkan metilen biru dengan fuchsin asam dan menyebut campuran tersebut sebagai pewarna netral, sebuah neutralen Farbkörper, yang memisahkan berbagai jenis sel darah putih ketika pewarna tunggal yang digunakan saat itu tidak mampu melakukannya. Dua tahun kemudian ia memperkenalkan metode metil violet untuk mewarnai basil tuberkulosis, dan Koch mengadopsi prosedur tersebut dalam pekerjaannya sendiri.

Teori yang kemudian memberikan dasar bersama bagi praktik-praktik ini adalah hal yang terpisah, dan tanggalnya sering kali disederhanakan. Teori rantai samping Ehrlich, yaitu gagasan bahwa suatu zat bekerja pada sel karena keduanya kompatibel secara kimia, berasal dari tahun 1890-an, bukan dari tahun-tahun eksperimen pewarna. Yang diberikan oleh penelitian awal adalah keyakinan pendahuluan: selektivitas bersifat kimia, dan karena itu selektivitas dapat dicari, bukan sekadar ditemukan secara kebetulan.

Eksperimen yang menjadikan pewarna sebagai peta

Pada tahun 1885 Ehrlich menerbitkan monograf tentang kebutuhan oksigen organisme, dengan subjudul studi analisis warna. Metodenya adalah menyuntikkan pewarna yang warnanya bergantung pada keadaan oksidasi, lalu membandingkan bagaimana organ berbeda mereduksi atau mempertahankannya. Pewarna digunakan sebagai instrumen, seperti termometer digunakan: pewarna melaporkan kondisi di dalam jaringan yang tidak dapat diamati secara langsung. Pernyataan Ehrlich sendiri tentang tujuannya adalah menentukan, dengan bantuan pewarna tertentu, daya reduksi organ hidup.

Hasil metilen biru muncul pada tahun 1886, dalam makalah tentang reaksi pewarna tersebut dengan substansi saraf hidup, yang dibacakan kepada sebuah perkumpulan medis pada bulan Desember sebelumnya. Metilen biru dimasukkan ke dalam sirkulasi hewan hidup, lalu irisan tipis jaringan diambil dan dipaparkan ke udara sehingga pewarna tak berwarna yang terkumpul teroksidasi kembali menjadi biru dan menunjukkan tempat terkumpulnya. Sel saraf dan serabut saraf mengambil warna tersebut, dan cukup selektif sehingga teknik ini menjadi metode standar untuk menunjukkan jaringan saraf. Senyawa tersebut tidak lagi hanya menjadi zat pewarna yang diterapkan pada potongan mati di meja laboratorium. Senyawa itu menjadi penanda yang menyebar sendiri di dalam tubuh hidup, dan penyebarannya dapat dibaca.

Sifat yang mendasari kedua eksperimen tersebut perlu dinyatakan dengan jelas, karena seluruh cerita ini bergantung padanya. Metilen biru bersifat reversibel. Bentuk tereduksinya, leucomethylene blue, tidak berwarna, dan ketika bersentuhan dengan oksigen ia kembali menjadi kation biru. Larutan glukosa dengan pewarna tersebut dalam botol tertutup tidak berwarna; buka botolnya dan larutan berubah menjadi biru. Ehrlich dilaporkan menunjukkan hal tersebut secara langsung dengan memperlakukan preparat berwarna menggunakan besi klorida serta udara dan mengamati kembalinya warna. Pewarna yang berubah warna sesuai keadaan redoks lingkungannya adalah sebuah probe untuk lingkungan tersebut.

Jadi dua sifat berada berdampingan. Sebuah pewarna dapat membedakan satu jaringan dari jaringan lain. Dan sebuah pewarna dapat dinyalakan dan dimatikan oleh perubahan keadaan oksidasi.

Jika dibaca secara terbalik, sifat kedua adalah awal dari kemoterapi. Jika suatu senyawa berikatan dengan satu jenis jaringan dan tidak dengan jenis lainnya, maka senyawa yang sama mungkin dapat mencapai satu jenis organisme dan tidak mencapai organisme lain. Ehrlich menyatakan kesimpulan tersebut secara langsung: jika patogen dapat diwarnai secara selektif, pewarnaan tersebut mungkin menunjukkan kerusakan khusus terhadap patogen tersebut. Sebuah pewarna karena itu mungkin dapat digunakan sebagai obat, diarahkan kepada penyerang dan bukan kepada pasien.

Uji pertama pada pasien bukan untuk malaria. Pada tahun 1890, bersama psikiater Arthur Leppmann, Ehrlich melaporkan bahwa metilen biru meredakan nyeri pada kondisi neuralgia dan rematik pada otot, sendi, dan tendon. Keduanya membahas apakah obat tersebut mungkin bekerja pada penyakit mental dan memutuskan untuk tidak mencobanya. Seorang dokter Italia, Pietro Bodoni dari Genoa, tetap melakukannya. Makalahnya pada tahun 1899 berjudul tentang efek sedatif dalam berbagai bentuk psikosis: ia menggambarkan ketenangan pada empat belas pasien yang gelisah, dan mencatat bahwa dokter lain di Genoa sudah menggunakan pewarna tersebut untuk tujuan yang sama. Sedasi bukanlah efek terhadap penyakit, dan perbedaan ini terus muncul dalam sejarah ini.

Penelitian malaria datang pada tahun 1891, bersama ahli patologi Paul Guttmann, di rumah sakit Moabit di Berlin. Metilen biru diberikan kepada dua pasien, dan laporan tersebut diterbitkan dalam Berliner klinische Wochenschrift tanggal 28 September 1891. Pada kasus pertama pasien meminum 0,5 g pewarna sekaligus pada malam 29 Juni; serangan yang diperkirakan tidak sepenuhnya terjadi, dan satu-satunya keluhan yang dicatat setelahnya adalah stranguria ringan dengan urin berwarna biru. Serangan demam menghilang selama hari-hari pertama, dan parasit hilang dari darah paling lambat pada hari kedelapan. Ringkasan penulis sendiri menyatakan bahwa harapan mereka sepenuhnya terpenuhi. Dua kasus tanpa kontrol bukanlah sebuah pembuktian. Penjelasan lebih lengkap tentang metilen biru dan malaria, termasuk uji modern, berada di halaman tersendiri, dan pertanyaan menarik di sini lebih sempit: seberapa banyak penalaran Ehrlich bertahan ketika diuji terhadap parasit.

Di mana penalaran tersebut benar dan di mana ia gagal

Tidak banyak mekanisme yang bertahan, setidaknya tidak dalam bentuk yang diusulkan Ehrlich. Versi sederhana, di mana kation trisiklis datar menyisip di antara pasangan basa DNA parasit, tidak berlaku untuk Plasmodium. Metilen biru sangat mudah direduksi oleh sel darah merah yang terinfeksi sehingga ia tidak pernah tiba di parasit sebagai kation datar, dan teori interkalasi yang sesuai dengan pewarna akridin tidak sesuai untuk senyawa ini.

Bukti yang ada mendukung penjelasan yang lebih rumit. Metilen biru menghambat glutathione reductase parasit pada konsentrasi yang dapat dicapai pasien. Senyawa ini menghambat konversi haem menjadi haemozoin, pigmen inert yang dibangun parasit untuk menghindari keracunan akibat pencernaan hemoglobinnya sendiri, dengan efektivitas kira-kira setara dengan klorokuin dan jauh lebih efektif daripada kuinina. Siklus redoksnya juga menghasilkan spesies oksigen reaktif dalam sel yang sudah memproduksinya. Mekanisme mana yang benar-benar berperan, atau apakah semuanya berkontribusi, masih belum ditentukan.

Ada komplikasi tambahan, dan hal ini harus membentuk cara membaca setiap klaim sejarah tentang senyawa ini. Metilen biru komersial pada masa itu bukanlah satu zat tunggal. Sampel mengandung azure B, kongener yang mengalami demetilasi tunggal, dan larutan lama mengakumulasi lebih banyak zat tersebut. Azure B adalah pewarna metakromatik dengan target berbeda: ia mewarnai DNA untai ganda menjadi biru tua dan RNA menjadi hijau. Campuran dua pewarna dengan tujuan berbeda, dalam proporsi yang tidak pernah dicatat, tidak dapat mendukung pernyataan yang jelas tentang apa yang dilakukan metilen biru di dalamnya.

Pewarna itu sendiri tidak pernah menggantikan kuinina. Metodenya yang bertahan. Murid Ehrlich, Wilhelm Roehl, yang bekerja untuk perusahaan pewarna dan obat IG Farben, terus mendorong turunan pewarna sebagai obat tropis dan menyediakan alat yang hilang: burung kenari, yang terinfeksi malaria burung, sebagai penyaring rutin senyawa kandidat. Werner Schulemann kemudian mengubah rantai samping, dan garam fenotiazinium yang dihasilkan menyembuhkan infeksi eksperimental. Senyawa tersebut tetap membuat pasien berwarna biru.

Hasil yang bertahan ternyata bukan pewarna atau sistem cincin, melainkan rantai samping. Penambahan gugus dialkilaminoalkilamino mengubah perilaku molekul tersebut, dan fragmen itu bertahan dalam setiap desain ulang berikutnya. Pertahankan gugus tersebut dan tukar cincin fenotiazin dengan akridin, hasilnya adalah kuinakrin. Tukar dengan kuinolin, hasilnya adalah klorokuin. Pamaquine, primaquine, dan amodiaquine, semuanya masih ada dalam katalog antimalaria, membawa gugus yang sama. Senyawa yang gagal sebagai pengobatan menyediakan bagian yang berhasil.

Hubungan dengan antipsikotik berjalan melalui cincin, bukan melalui obatnya. Penjelasan struktur metilen biru adalah yang membawa Heinrich August Bernthsen kepada inti fenotiazin pada tahun 1883, dan kerangka tersebut, dengan substitusi berbeda, adalah yang dikerjakan oleh ahli kimia di Rhône-Poulenc pada tahun 1940-an ketika mencari antihistamin. Salah satu senyawa tersebut disintesis sekitar akhir tahun 1950 dan diuji oleh ahli bedah Henri Laborit, yang memperhatikan bahwa senyawa tersebut membuat pasien tenang dan tidak peduli. Penggunaan psikiatri pertama yang dipublikasikan, pada pasien dengan mania, muncul pada Januari 1952. Antipsikotik pertama bukan keturunan langsung dari antimalaria Ehrlich, melainkan kerabat jauh dari pewarna yang ia mulai.

Tiga kebiasaan dari episode ini yang layak dipertahankan

1. "Obat sintetis pertama yang digunakan dalam kedokteran" menggambarkan sebuah kategori, dan kualifikasinya lebih besar daripada yang tampak. Frasa tersebut telah menjadi hal umum; sebuah ulasan yang banyak dikutip oleh Schirmer dan rekan-rekannya dalam Neurobiology of Aging menyebut metilen biru sebagai obat sintetis sepenuhnya pertama yang digunakan dalam kedokteran. Kloral hidrat diperkenalkan sebagai sedatif sintetis pada tahun 1869, lebih dari dua puluh tahun sebelumnya. Makalah tahun 1891 itu sendiri memberikan sebagian jawabannya, karena penulis menyebut antiperetik sintetis yang sebelumnya gagal melawan malaria, termasuk kuinolin, antipirin, dan antifebrin. Arsenik sintetis Ehrlich untuk sifilis muncul lebih kemudian. Versi klaim yang dapat dipertahankan adalah tentang metode, bukan prioritas: metilen biru termasuk di antara senyawa sintetis awal yang dipilih untuk bekerja melawan organisme tertentu berdasarkan teori kimia tentang selektivitas.
2. Distribusi selektif bukanlah manfaat selektif. Hasil Ehrlich pada tahun 1886 adalah bahwa pewarna tersebut menuju jaringan saraf. Ke mana sebuah senyawa pergi dan apa yang dilakukannya setelah tiba adalah dua pengukuran berbeda, dan yang pertama jauh lebih mudah dilakukan. Celah tersebut menjadi tempat sebagian besar klaim tentang metilen biru dan otak berada sejak saat itu.
3. Kemurnian adalah bagian dari bukti, bukan bagian dari pemasaran. Catatan sejarah menjadi ambigu tepat karena alasan ini. Perbedaan struktur kecil mengubah ke mana senyawa ini pergi, sehingga sertifikat analisis harus dikaitkan dengan lot tertentu, bukan ditawarkan sebagai pernyataan bahwa sebuah produk telah diuji. Penjual yang mengklaim kesesuaian dengan monograf farmakope sementara hanya menguji logam berat membuat klaim yang melebihi dukungan laporan. Blupreme memperoleh metilen biru dari produsen farmasi dan menguji seluruh spesifikasi yang ditetapkan monograf: identitas, kemurnian, pengotor organik, pelarut residu, pengotor unsur, residu pembakaran, batas mikroba, dan endotoksin bakteri. Laporan tersebut diterbitkan bersama produk, dan halaman USP grade methylene blue menjelaskan batas tersebut serta mengapa hasil azure B adalah hal pertama yang harus diperiksa.

Jejak sumber berdasarkan tanggal