Մեթիլենային կապույտը և միտոքոնդրիաները. էլեկտրոնների փոխադրումը և ապացույցները

Պատկերացրեք կողք կողքի դրված երկու պատրաստուկ։ Երկուսն էլ պարունակում են գլխուղեղի միտոքոնդրիաներ, որոնք թունավորված են ռոտենոնով՝ շնչառական շղթայի I համալիրը արգելափակող քիմիական նյութով։ Դրանցից մեկի մեջ փորձարարը պիպետով ավելացնում է մեթիլենային կապույտի միկրոմոլար չափաբաժին։ Թթվածնի սպառումը մասամբ վերականգնվում է։ Թաղանթային լարումը մասամբ վերադառնում է։ ATP-ի սինթեզը փոքր չափով վերսկսվում է։ Հարևան կյուվետում պերօքսիդի տվիչը բացահայտում է պատկերի մյուս կեսը. ջրածնի պերօքսիդի առաջացումը մի քանի անգամ ավելացել է՝ փորձարկված յուրաքանչյուր չափաբաժնի և յուրաքանչյուր սուբստրատի դեպքում։

Երկու չափումներն էլ ճիշտ են։ Մեթիլենային կապույտը էլեկտրոնների փոխադրիչ է, որը կարող է պահպանել հոսքը՝ շրջանցելով շնչառական շղթայի վնասված հատվածը, իսկ նույն փոխադրիչը դա անելիս պերօքսիդային գին է պահանջում։ Եթե այս երկու փաստերը միաժամանակ նկատի պահեք, մեթիլենային կապույտի և միտոքոնդրիալ գործառույթի մասին գրականությունը հասկանալի կդառնա։ Եթե նկատի պահեք միայն մեկը, այն կընթերցվի որպես հրաշքի կամ սպառնալիքի պատմություն՝ կախված նրանից, թե որ հոդվածն եք առաջինը բացել։

Փոխադրիչի պարզ նկարագրությունը

Շնչառական շղթան փոխանցումների հաջորդականություն է։ Էլեկտրոնները մուտք են գործում I համալիրում՝ NADH-ից, կամ II համալիրում և հարակից ֆլավինային ֆերմենտներում՝ սուկցինատից և նմանատիպ դոնորներից, III համալիրով անցնում են շարժուն կրող ցիտոքրոմ c-ին, ապա IV համալիրով՝ թթվածնին։ Յուրաքանչյուր փոխանցում պրոտոններ է մղում ներքին թաղանթի միջով, իսկ առաջացած գրադիենտը շարժիչ ուժ է տալիս ATP-ի սինթեզին։ Արգելափակեք որևէ օղակ, և դրան նախորդող հատվածում հոսքը կդադարի։

Մեթիլենային կապույտը միանում է որպես զուգահեռ առաքիչ։ Դրա օքսիդացված ձևը էլեկտրոններ է վերցնում շղթայի նախորդ հատվածների կրողներից՝ վերածվելով անգույն, վերականգնված ձևի՝ լեյկոմեթիլենային կապույտի։ Այն հետո այդ էլեկտրոնները փոխանցում է շղթայի հաջորդ հատվածներին և կրկին կապույտ է դառնում։ Երկու ձևերը նկարագրված են օքսիդավերականգնման զույգի մասին հոդվածում, իսկ փոխանցման ավելի ընդհանուր վարքագիծը՝ մեխանիզմի ընդհանուր բացատրության մեջ։ Բաց հարցն այն է, թե առաքիչը որտեղ է կրկին միանում շղթային՝ III համալիրի՝ քինոլը կապող հատվածում, որը հայտնի է որպես Qo տեղամաս, թե անմիջապես ցիտոքրոմ c-ի մոտ։ Թե որ ելքն է գերակշռում, կախված է պայմաններից, ինչպես մանրամասն ներկայացված է III համալիրի շրջանցման վերլուծության մեջ։

Ինչ են իրականում չափել կրծողների երեք հետազոտություններում

Երեք հետազոտություններն էլ օգտագործել են գլխուղեղի մեկուսացված միտոքոնդրիաներ, այսինքն՝ բջջից հանված և սահմանված բաղադրությամբ բուֆերային լուծույթում կախույթ կազմող օրգանելներ։ Չեն օգտագործվել ամբողջական բջիջներ, նյութը ստացած կենդանիներ կամ հետազոտության մասնակից մարդիկ։ Կոնցենտրացիաները վերաբերում են օրգանելները շրջապատող լուծույթին, ոչ թե մարդու բերանային ընդունման չափաբաժնին։ Այս շրջանակը հստակ պահելու դեպքում թվերը պարզ իմաստ են ստանում։

Առաջին հետազոտությունը՝ ծովախոզուկի գլխուղեղի մեկուսացված միտոքոնդրիաներում՝ 100 նանոմոլարից մինչև 2 միկրոմոլար կոնցենտրացիաներով, մեկ պատրաստուկում գնահատել է և՛ օգուտը, և՛ դրա գինը։ Առողջ միտոքոնդրիաներում ներկանյութը բարձրացրել է հանգստի վիճակում թթվածնի սպառումը, բայց անփոփոխ է թողել ADP-ով խթանված շնչառությունը, ուստի դրա հետ զուգակցված ATP-ի արտադրությունը չի բարելավվել։ I համալիրի արգելափակման պայմաններում 2 միկրոմոլարը ATP-ի սինթեզը 46-ից հասցրել է 93 նանոմոլի՝ րոպեում մեկ միլիգրամի հաշվով, մինչդեռ բնականոն արագությունը մոտ 1109 էր։ III համալիրի արգելափակման դեպքում նույն չափաբաժինը ATP-ի սինթեզը մոտ 46-ից հասցրել է 63-ի, մինչդեռ բնականոն արագությունը մոտ 910 էր։ Լարումը և կալցիումի կլանումը մասամբ վերականգնվել են։ IV համալիրի ցիանիդային արգելափակումը հնարավոր չէր շրջանցել, ինչը ցույց է տալիս, որ էլեկտրոնների օգտակար ելքը գտնվում է գործող IV համալիրից առաջ։ Գործառույթի վերականգնման յուրաքանչյուր դեպք վիճակագրորեն իրական էր, բայց փոքր՝ բնականոն ATP-ի արտադրության միանիշ տոկոսների սահմաններում։

Երկրորդ հետազոտությունը՝ մկան գլխուղեղի կեղևի միտոքոնդրիաներում՝ մոտ 1 միկրոմոլար կոնցենտրացիայով, հաստատել է I համալիրի շրջանցումը և սահման է դրել III համալիրի մոտ։ Ռոտենոնը շնչառությունը մոտ 121-ից իջեցրել է մինչև 2 նանոմոլից պակաս թթվածին՝ րոպեում մեկ միլիգրամի հաշվով, իսկ ներկանյութն այն բարձրացրել է մինչև մոտ 21՝ բնականոն մակարդակի մոտ մեկ վեցերորդը, մինչդեռ թաղանթային լարումը գրեթե լիովին վերականգնվել է։ Սակայն III համալիրի արգելափակումից հետո 1-ից 5 միկրոմոլար միջակայքում չեն վերականգնվել ո՛չ շնչառությունը, ո՛չ լարումը, իսկ արգելափակումը ճնշել է ներկանյութով պայմանավորված պերօքսիդային ազդանշանը։ Հեղինակներն առաջարկել են, որ վերականգնված ներկանյութն իր էլեկտրոնները փոխանցում է III համալիրի Qo տեղամասում. երբ այդ տեղամասը զբաղված է, առաքիչը փոխանցելու տեղ չունի։

Երրորդ հետազոտությունը՝ մկան, առնետի և ծովախոզուկի գլխուղեղի միտոքոնդրիաներում՝ հիմնականում 2 միկրոմոլար կոնցենտրացիայով, ուղղակիորեն ստուգել է այս անհամաձայնությունը և պարզել, որ III համալիրի արգելափակումը հնարավոր է շրջանցել։ Երբ Qo տեղամասի արգելակիչ միքսոթիազոլը ելակետային շնչառությունը նվազեցրել է 88 տոկոսով, ներկանյութը թթվածնի սպառումը վերականգնել է մինչև չարգելափակված արագության մոտ 62 տոկոսը։ Ուղղակի փորձարկման ժամանակ կես միկրոմոլարը վերականգնել է արտաքինից ավելացված ցիտոքրոմ c-ն նույնիսկ այն դեպքում, երբ III համալիրն արգելափակված էր՝ հաստատելով NADH-ից ներկանյութով դեպի ցիտոքրոմ c, ապա դեպի IV համալիր տանող ուղու հնարավորությունը։ Սակայն վերականգնված շնչառությունն անբնական վարքագիծ է դրսևորել. ավելացված ADP-ն թթվածնի սպառումը բարձրացնելու փոխարեն նվազեցրել է այն, իսկ ATP-ի սինթեզի արգելափակումը խթանել է շնչառությունը։ Լարումը միայն մասամբ է վերականգնվել։ Հակադարձ զուգակցմամբ թթվածնի բարձր սպառումը բնականոն էներգիայի արտադրություն չէ։

Ինչու են լաբորատորիաների արդյունքները տարբերվում, և ինչն է պարզաբանում հարցը

Տեսակային տարբերության բացատրությունն առաջինն է հերքվում։ Երրորդ խումբը աշխատանքը կրկնել է երեք կրծողների մոտ և բոլորի դեպքում ստացել որակապես նույն շրջանցումը՝ ներառյալ մկների այն գիծը, որի դեպքում նախկինում հաղորդվել էր շրջանցման բացակայություն։ Փոխարենը տարբերվում են կոնցենտրացիան՝ 1՝ ընդդեմ 2 միկրոմոլարի, արգելակիչների չափաբաժինները, բուֆերները, մեկուսացման մեթոդները և, ամենից առաջ, համեմատվող էներգետիկ վիճակը. շրջանցումն ամենահստակն է մինչև ADP-ի ավելացումը՝ հենց այն պայմաններում, որոնցում ի հայտ է գալիս ADP-ի նկատմամբ պարադոքսային արձագանքը։ Ուստի ճշգրիտ գծապատկերը ցույց է տալիս պայմաններից կախված երկու ելք՝ մեկը Qo տեղամասում, մյուսը՝ ցիտոքրոմ c-ի մոտ։ Առաքիչն էլեկտրոնները փոխանցում է այնտեղ, որտեղ տեղային քիմիան դա թույլ է տալիս։

Պերօքսիդային գինը

Գնի մասին տվյալները նույնքան հետևողական են, որքան գործառույթի վերականգնման մասին տվյալները։ Ծովախոզուկի հետազոտությունում ներկանյութը բարձրացրել է պերօքսիդի արտազատումը փորձարկված բոլոր պայմաններում՝ հանգստի վիճակում, ATP-ի սինթեզի ընթացքում և քիմիական խանգարման պայմաններում՝ բոլոր երեք սուբստրատների դեպքում։ ATP-ի սինթեզի ընթացքում 1 միկրոմոլար կոնցենտրացիայի դեպքում արտադրությունը մոտ 148-ից աճել է մինչև ավելի քան 1500 պիկոմոլ՝ րոպեում մեկ միլիգրամի հաշվով, իսկ նույնիսկ 100 նանոմոլարի դեպքում ազդանշանն ավելի քան քառապատկվել է։ Ներկանյութը նաև մոտ 2.6 անգամ դանդաղեցրել է պերօքսիդի հեռացումը, ուստի ազդանշանն արտացոլում է և՛ ավելի արագ առաջացումը, և՛ ավելի դանդաղ հեռացումը։ Առաջարկված քիմիական բացատրությունը վերականգնված ներկանյութի կողմից թթվածնի ուղղակի վերականգնումն է՝ առանց հայտնաբերվող սուպերօքսիդի, թեև դա դեռ մեկնաբանություն է, ոչ թե ապացուցված քայլ։

Մկների հետազոտությունը պատկերը բարդացնում է օգտակար ձևով։ Պերօքսիդը չափաբաժնի հետ կտրուկ աճել է՝ մոտ 76 ելակետային մակարդակից հասնելով գրեթե 2000 պիկոմոլի՝ րոպեում մեկ միլիգրամի հաշվով, 2 միկրոմոլար կոնցենտրացիայի դեպքում, բայց III համալիրի արգելափակումը ճնշել է ներկանյութով պայմանավորված բաղադրիչը։ Եթե պերօքսիդն առաջանար միայն վերականգնված ներկանյութի և թթվածնի փոխազդեցությունից, շղթայի արգելափակումն այդքան մեծ նշանակություն չպետք է ունենար։ Բայց այն ունի, հետևաբար շղթան մասնակցում է։ Հակաօքսիդանտ և պրոօքսիդանտ հատկությունների ակնարկը այս երկակիությունը դիտարկում է ավելի լայն համատեքստում, իսկ թթվածնի և ATP-ի համեմատական վերլուծությունը բացատրում է, թե ինչու միայն թթվածնի թվերը երբեք չեն կարող հիմնավորել էներգիայի մասին պնդումը։

Գործառույթի մասնակի վերականգնումը վերանորոգում չէ

Շրջանառությունից հանելու կարիք ունեցող ձևակերպումն է՝ «արդյո՞ք մեթիլենային կապույտը վերանորոգում է միտոքոնդրիաները»։ Վերանորոգումը կնշանակեր տևական շտկում՝ վերակառուցված համալիրներ, զուգակցում, որը պահպանվում է նյութի հեռանալուց հետո, վերականգնում ամբողջական բջիջներում, ապա գործառույթի բարելավում կենդանի օրգանիզմում։ Երեք հոդվածներից ոչ մեկը դա չի ցույց տալիս։ Դրանք ցույց են տալիս ուղու կարճաժամկետ փոփոխություն նոր մեկուսացված օրգանելներում՝ արհեստական քիմիական արգելափակման պայմաններում, երբ ATP-ի արտադրությունը կազմում է բնականոն մակարդակի փոքր մասը, իսկ զուգակցումը երբեմն բացահայտ տարօրինակ է։ Ռոտենոնը և անտիմիցինը լաբորատոր գործիքներ են, ոչ թե ծերացման կամ մարդու միտոքոնդրիալ հիվանդության մոդելներ, և այստեղ ոչինչ չի նշանակում առողջ մարդու համար ավելի շատ էներգիա։ Դա ապացույցների առանձին հարց է՝ մարդկանց վերաբերյալ իր սեփական հետազոտական գրականությամբ։

Երեք սահմանափակում օգնում է բիոհաքինգի ցանկացած եզրակացություն ճշգրիտ պահել։ Առաջին՝ շրջապատող լուծույթի կոնցենտրացիան ընդունման չափաբաժին չէ. մեկուսացված օրգանելների շուրջ 0.1-ից 2 միկրոմոլար կոնցենտրացիան ոչինչ չի ասում այն մասին, թե բերանային ընդունման ինչ քանակություն է մարդու գլխուղեղի միտոքոնդրիայի մոտ ստեղծում այդ ազատ կոնցենտրացիան, հատկապես քանի որ ներկանյութի կուտակումը կամ արտազատումը կախված է հենց թաղանթային լարումից։ Երկրորդ՝ թթվածինը էներգիա չէ. ներկանյութը կարող է բարձրացնել թթվածնի սպառումը ինչպես ցիկլային գործընթացների և արտահոսքի, այնպես էլ արդյունավետ ֆոսֆորիլացման միջոցով, ուստի առանց ATP-ի և լարման չափումների շնչառության չափումը չի կարող հիմք տալ էներգիայի մասին պնդման համար։ Երրորդ՝ օգուտն ու բեռը պետք է նշվեն նույն նախադասության մեջ. լարման կամ ATP-ի վերականգնման մասին ցանկացած պնդում, որը բաց է թողնում պերօքսիդի միաժամանակյա աճը, սխալ է ներկայացնում փորձը։ Հարակից վերապահումներն ընդգրկում են NAD-ի օքսիդավերականգնման հավասարակշռությունը, չափաբաժին–արձագանք կորի ձևը և փորձարկումների ուղեցույցը։

Մեկ գործնական նշում. փոխադրիչի այս հատկությունը բնորոշ է հենց տվյալ մոլեկուլին։ Դեմեթիլացված հարակից նյութերը, օրինակ՝ Azure B-ն, նույնպես օքսիդավերականգնման ակտիվություն ունեն, բայց այլ վարքագծով, ուստի մասամբ քայքայված լուծույթով փորձը տարբերվում է չքայքայված ներկանյութով փորձից։ Սա պատճառներից մեկն է պահանջելու դեղագրքային ամբողջական բնութագրերին համապատասխանություն և խմբաքանակի հրապարակված փաստաթուղթ՝ միայն մետաղների ստուգման փոխարեն։ Լույսով պայմանավորված քիմիան զուգահեռ վերապահում է ավելացնում լուսավորված պայմաններում կիրառությունների համար, ինչը քննարկվում է կարմիր լույսի հետ համակցումների մասին հոդվածում։

Նեղ պնդումն այս ամենից հետո մնում է ուժի մեջ և արժե պահպանել. մեթիլենային կապույտը կարող է վնասված մեկուսացված միտոքոնդրիաներում գործել որպես պայմաններից կախված էլեկտրոնային առաքիչ՝ մասամբ պահպանելով հոսքը պերօքսիդային գնով։ Դրանից այն կողմ ամեն ինչ՝ էներգիան, երկարակեցությունը, վերանորոգումը, սպասում է ապացույցների, որոնք այս հետազոտություններն ի սկզբանե նախատեսված չէին տրամադրելու։