A metilénkéket a sejtlégzéssel összekapcsoló kísérletek

A fibrinmentesített emberi vér három órán át 37 °C-on tartva a benne lévő oxigén körülbelül két százalékát fogyasztja el. Ha az inkubálás előtt kis mennyiségű metilénkéket adunk hozzá, ugyanez a vér körülbelül hatvanöt százalékot fogyaszt el. A sejtekben semmi sem változott. Csak az oldatban.

Ez az adat George Harrop és E. S. Guzman Barron, a Johns Hopkins kutatóinak 1928-as tanulmányából származik, és innen ered az a széles körben ismételt állítás, hogy a metilénkék javítja a sejtlégzést. Az állítás nem hamis, de szűkebb érvényű, mint amilyennek hangzik.

Mit mér valójában a táblázatban szereplő szám?

A végpont a gázelemzéssel meghatározott oxigénfelvétel volt. Harrop és Barron a frissen levett vért 10 °C-on vattán szűrte át, hogy eltávolítsa a fehérvérsejteket, majd oxigénnel telítette a mintát, kettéosztotta, az egyik részhez festéket adott, és az inkubálás után mindkettőt elemezte. A fehérvérsejtszám ritkán haladta meg a köbmilliméterenkénti körülbelül ezer sejtet. Az oxigénfogyasztást a minta kezdeti oxigéntartalmának eltűnt hányadaként adták meg.

Szén-dioxidot is mértek, de ennél a módszer nehézségekbe ütközött. A fibrinmentesített vér az inkubálás első órájában 100 mL-enként akár két millimól szén-dioxidot is felszabadított, a vizsgált reakciótól független okokból, ezért a teljes vérből számított légzési hányadosok használhatatlanok voltak. Csak a Locke-oldatban szuszpendált, mosott sejtek adtak értelmezhető adatokat, amelyek festékkel és anélkül is 0.73 és 0.80 között csoportosultak.

Ez nem jelentéktelen részlet. Ezekben a tanulmányokban a „légzés” zárt edényben zajló gázcserét jelent. Az oxigénfogyasztás és a hasznos energiatermelés közötti különbséget külön vizsgálja a mit árul el az oxigénfogyasztás az ATP-ről, és mit nem című cikk.

A festék ott növelte leginkább a légzést, ahol a sejtek a legkevésbé lélegeztek

Az emlősök érett vörösvérsejtjeinek szinte nincs mérhető oxigénfogyasztásuk. A madarak sejtmagvas vörösvérsejtjeinek van. Harrop és Barron mindkettőt vizsgálta, és ez a különbség adja érvelésük gerincét.

Az emlősökből származó mintákban a festék húsz-ötvenszeres növekedést eredményezett. A lúdvérben, amelynek sejtjei eleve lélegeztek, a sebesség soha nem nőtt a kétszeresénél nagyobbra. Minél nagyobb volt a kiindulási légzés, annál kevesebbet tudott hozzátenni a festék.

Ugyanez a tendencia egy fajon belül is megjelent. Egy polycythaemia verában szenvedő betegtől származó, éretlen sejteket tartalmazó emberi vérminta festék nélkül oxigéntartalmának 11.3 százalékát fogyasztotta el, szemben egy egészséges donor mosott sejtjeinek 2.8 százalékával. A festék ezt csak 63.4 százalékra emelte: hatszoros gyorsulást okozott, miközben a normál sejtek légzése közel harmincszorosára gyorsult. A festék az érett sejtek viselkedését az éretlen sejtekéhez közelítette, és a szerzők is így írták le a hatását.

A cianidnak le kellett volna állítania

Ismert volt, hogy a cianid leállítja a sejtek oxidációs folyamatait. Harrop és Barron mégis hozzáadta a festék mellé.

A szarvasmarhavérrel kapott eredmények jól szemléltetik a jelenséget. Adalékok nélkül az oxigéntartalom három óra alatt 22.61 térfogatszázalékról 22.03-ra csökkent. Metilénkékkel 12.84-re esett. Metilénkék és egy ötezred mólos kálium-cianid jelenlétében 12.74-re csökkent. A festék hatása lényegében változatlan maradt.

Ábra: emberi vörösvérsejtek folyamatos mikrolégzési regisztrátuma. A nyíl a metilénkék hozzáadását jelzi. Előtte a görbe szinte vízszintes, utána egyenletesen emelkedik. Harrop és Barron nyomán, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Arra jutottak, hogy a festék oxigénhordozóként működik, „olyan anyagot pótolva, amely eltűnt a kifejlett emlősök sejtmag nélküli vörösvérsejtjeiből”. Két évvel később a Rockefeller Intézetben dolgozó Michaelis és Salomon tartósan érvényes formába öntötte a nézetkülönbséget. A festék hatása vagy „a festék véletlenszerű tulajdonsága”, vagy a festék „a szervezetekben található valamely ismeretlen anyag modellje”. Ez a kérdés máig nem dőlt el. Az változott, hogy a sejteket ma már sokkal pontosabban tudjuk leírni.

Egy májkivonat ugyanezt tette

Michaelis és Salomon kimutatta, hogy a szervekből hideg vízzel készített kivonatok ugyanilyen serkentő hatást fejtenek ki. A patkánymáj hatása volt a legerősebb, ezt a vese, a lép és a here követte. Az agy, az izom és a vérszérum alig vagy egyáltalán nem hatott.

Ezután szén-monoxid jelenlétében vizsgálták a kivonatot. Akár a kivonat, akár a festék által kiváltott légzés változatlan maradt 98 százalék szén-monoxidot és 2 százalék oxigént tartalmazó keverékben. Ugyanez a gázkeverék nagyjából 60–80 százalékkal gátolta az élesztő és a házityúk sejtmagvas vörösvérsejtjeinek légzését, összhangban Warburg leírásával a szén-monoxidra érzékeny légzési fermentumról. Az azonosítatlan szöveti anyag tehát nem Warburg enzime volt.

A vizsgálatok során több lehetséges jelöltet is kizártak. A redukált glutation és a cisztein csak a saját oxidációjukhoz szükséges oxigénfogyasztást idézték elő. Harden és Young koenzimét azért vetették el, mert az izom tartalmazza belőle a legtöbbet, mégis szinte a legkisebb hatást mutatta. A néhány évvel korábban elnevezett Keilin-féle citokróm esetében ugyanez az ellentmondás merült fel. Saját elképzelésüket, miszerint a hatóanyag a sejtmagból származik, puszta felvetésnek nevezték.

A hatás feltételekhez kötődött

A sejteknek épnek kellett lenniük. A desztillált vízzel vagy ismételt fagyasztással előidézett hemolízis megszüntette mind a festékre, mind a kivonatra adott választ, a részleges hemolízis pedig arányosan csökkentette azt.

Cukorra is szükség volt. A glükóz, a fruktóz és a szacharóz támogatta a festék által kiváltott légzést, a mannit nem. Cukor nélkül egyáltalán nem volt légzés, és úgy tűnt, hogy a festék közben károsítja a sejteket, így az egy-két órával később hozzáadott glükóz sem állította helyre a folyamatot. A szerzők feltételezése szerint a festék a sejt számára szükséges valamely szerkezeti összetevőt oxidált.

A megvilágítás jelentősen fokozta a festék hatását, bár az sötétben is egyértelmű volt. Más redukálható festékek eltérően viselkedtek: a toluilénkék hatása elérte vagy meghaladta a metilénkékét, míg az indigó-diszulfonát szinte semmit sem tett. Nem rajzolódott ki egyértelmű összefüggés a festék oxidációs-redukciós potenciálja és hatásának mértéke között; ezt a szerzők a membránáteresztő képességgel és a toxicitással magyarázták.

A hatás az erjedést követte, nem a légzést

Barron 1930-as vizsgálata a sejtszuszpenziókról normál patkányszervek és átültetett daganatok szövetszeleteire tért át.

Az aerob glikolízist nem mutató szövetekben a metilénkék nem hatott, vagy enyhén csökkentette az oxigénfogyasztást: a vesében körülbelül 14 százalékkal, a hasnyálmirigyben körülbelül 14 százalékkal, a májban körülbelül 5 százalékkal. Az oxigén jelenlétében is erjedést végző szövetekben növelte a fogyasztást: a lépben körülbelül 8 százalékkal, az agyban körülbelül 13 százalékkal. A daganatokban mért növekedés egy emberi emlőkarcinóma körülbelül 27 százalékos értékétől a csirke Rous-szarkómájának több mint 80 százalékos értékéig terjedt, nagyjából az egyes szövetek aerob glikolízisével arányosan.

Ábra: minden pont egy szövettípust jelöl. A vízszintes tengely az aerob glikolízist, a függőleges tengely a metilénkék hozzáadása utáni oxigénfogyasztás-változást mutatja. Adatok: Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), 6. táblázat, PMID 19869777.

A cianidos kísérlet ezután a fordított képet adta. Amikor e korábban nem reagáló szövetek légzését cianiddal blokkolták, és az erjedés előtérbe került, a festék ismét növelte az oxigénfogyasztást: a vesében körülbelül 59 százalékkal, a májban körülbelül 19 százalékkal, a lépben körülbelül 286 százalékkal, a herében körülbelül 200 százalékkal.

Barron felvetette, hogy a festék alkalmas lehet egy sejt vagy szövet erjesztőképességének vizsgálatára, és egy feltételezéssel zárta tanulmányát: a daganatsejtek több nemzedéken át történő tenyésztése festéket tartalmazó tápközegben egyszer talán tartósan a normál szövetéhez hasonlóvá teheti a daganat anyagcseréjét. Ez egy 1930-ban megfogalmazott kutatási kérdés volt. Nem kezelésre vonatkozó állítás.

Mit nem mérhettek ezek a kísérletek?

1928-ban és 1930-ban a „légzés” oxigénfogyasztást jelentett. Az adenozin-trifoszfátról először 1929-ben számoltak be, és csak 1949-ben igazolták, hogy az izolált mitokondriumok elektronátadás közben foszfátot észtereznek. A korai metilénkék-tanulmányok egyike sem mérhette az energiatermelést, és egyik sem állította, hogy ezt tette.

A második probléma magukban a sejtekben rejlik. Az emlősök érett vörösvérsejtjei nem tartalmaznak mitokondriumokat. A retikulocita-stádiumban szelektív autofágiával eltávolítják a mitokondriumokat és a riboszómákat, ezért az érett vörösvérsejt glikolízisből nyeri az energiáját, és pentóz-foszfát útvonalára főként a NADPH, nem pedig az ATP miatt támaszkodik. Az 1928-as kísérletekben nem volt jelen helyreállítható elektrontranszportlánc. Bármi fogyasztotta is az oxigént, valami mást végzett.

Ma már meglehetősen jól leírható, mi volt ez a másik folyamat. A metilénkék elektronokat vesz át a sejt redukáló ekvivalenseitől, és leukometilénkékké alakul, amelyet a molekuláris oxigén újra oxidál, így a ciklus bezárul. Az emberi vörösvérsejtekben a redukciós lépést NADPH-függő flavin-reduktáz és rokon diszulfid-reduktázok végzik. Egy jelölt glükózzal végzett 1976-os vizsgálat kimutatta, hogy a festék serkenti a hexóz-monofoszfát söntöt, hogy a kis koncentrációnál megfigyelt hatás oxihemoglobintól függött, és hogy egy nagyobb, 0.1 mM koncentráció hidrogén-peroxidot termelt. Az oxigénnel találkozó redukált festék peroxidot hoz létre, nem foszfátkötéseket.

A mitokondriumok esetében a kép vitatottabb, mint azt a népszerű összefoglalók elismerik. Egy kutatási irány szerint a festék az I. komplex környezetéből vesz fel elektronokat, és a citokróm c-nek adja át őket. Egy másik vizsgálat azt találta, hogy egéragy mitokondriumaiban antimikinnel kiváltott gátlás után nem képes helyreállítani a légzést, és az elektronakceptort inkább a III. komplex ubikinolkötő helyére helyezte. Egy harmadik szerint kis koncentrációkban növelte a nyugalmi oxigénfogyasztást, miközben az ADP által serkentett légzést változatlanul hagyta. A lényeget a legközvetlenebbül az az eredmény fogalmazza meg, hogy a metilénkék által kiváltott oxigénfogyasztás egyáltalán nem függ az oxidatív foszforilációtól: a légzési lánc gátlásakor és légzési láncot nem tartalmazó preparátumokban is fennmaradt.

A két mennyiség közötti eltérésről közvetlen mérések is rendelkezésre állnak. Izolált patkánymáj-mitokondriumokban a festék növekvő koncentrációja csökkentette a légzési kontrollhányadosokat, és duzzadást okozott, amit a szerzők az oxidatív foszforiláció szétkapcsolásaként írtak le. Perfúzióval ellátott patkánymájban a metilénkék növelte az oxigénfogyasztást, miközben az ATP/ADP arány csökkent.

A klinikai tapasztalatok ugyanezt az üzenetet hordozzák. A methemoglobinémiát kilogrammonként nagyjából egy-két milligramm intravénásan beadott metilénkékkel kezelik, egy NADPH-függő redukciós útvonalon keresztül, a nagyobb adagok pedig éppen a kezelt állapotot idézik elő. Ugyanez az áttekintés megjegyzi, hogy az ellenszerhatás ép vörösvérsejtekben a legerősebb, hemolízis jelenlétében pedig csökken: az 1930-as hemolízisvizsgálat eredménye hetvenhárom évvel később, kórházi környezetben jelenik meg újra. Egy olyan vegyület adagját, amelynek hasznos és káros hatásait egy dózisküszöb választja el, nem szabad oxigénfogyasztási mérésből meghatározni.

Miért tartozik ide a gyártási tétel?

Harrop és Barron észrevett valamit, amit érdemes újra elolvasni. Maga a metilénkék a methemoglobin két jellegzetes sávja között egy sávot hoz létre a spektroszkópban, „ami felületes megfigyeléskor könnyen zavart okozhat”. A festék utánozhatja azt az anyagot, amelyet keresünk.

Ugyanez a probléma kémiai formában is jelentkezik. Egy kisebb arányban jelen lévő, rokon fenotiazin saját redoxviselkedéssel, membránáteresztő képességgel és toxicitással rendelkezik. Egy dokumentált eset kézzelfoghatóvá teszi a tétet: a metilénkék jódozását vizsgáló tanulmányban a körülbelül 7–8 százalék Azure B-t tartalmazó mintákból főként jódozott Azure B keletkezett, vagyis a reakcióban nem a metilénkék, hanem a szennyező dominált.

Aki metilénkéket használ reagensként, laboratóriumban, festési munkaállomáson vagy akváriumban, nem pontosan meghatározott összetevővel dolgozik, ha a gyártási tételt nem jellemezték. A rokon anyagok, az azonosság, az elemi szennyezők, a maradék oldószerek és az izzítási maradék a kísérlet részei, nem pusztán a körülötte lévő papírmunka. A Blupreme gyógyszergyártótól szerzi be metilénkékjét, és teljes analitikai tanúsítványt tesz közzé: nem csupán a nehézfémeket, hanem a teljes USP-specifikációt vizsgáltatja. Az útmutató az analitikai tanúsítvány értelmezéséhez és a mit igazol az USP-minőség megjelölés, és mit nem című cikk bemutatja, hogyan vethető össze a dokumentum az állítással.

A szám helyes volt

Az 1928-as és 1930-as kísérleteket gondosan végezték, és központi megfigyelésük kiállta az idő próbáját: egy redukálható festék az alig lélegző sejtet nyugalmi oxigénfogyasztásának többszörösére késztetheti anélkül, hogy a folyamat áthaladna a cianid által blokkolt lépésen.

A tévedés később jelenik meg, amikor a „légzést” mai jelentésében olvassuk. A gázcsere mérése azt árulja el, hogy elektronok jutottak el az oxigénhez. Azt nem mondja meg, hogy közülük bármelyiket ATP előállítására használták-e, és egy mitokondrium nélküli sejtben e két állítás között a lehető legnagyobb a távolság. A metilénkék sejtekben kifejtett hatásainak átfogó térképe tágabb összefüggésbe helyezi ugyanezt a különbséget, a vegyület története a festéktől a gyógyszerig pedig elmagyarázza, hogyan jutott el egy textilfesték egyáltalán ezekhez a kísérletekhez.