A metilénkék története: a festéktől a gyógyszerig és a kutatásig

A metilénkék előbb jutott el egy beteghez, mint egy gyógyszertárba.

Paul Guttmann és Paul Ehrlich 1891-es beszámolója a festék malária elleni alkalmazásáról két hőmérsékleti grafikont tartalmaz. A második 13 July és 5 August közötti időszakot mutatja, a kezelés pedig napról napra fel van tüntetve a margón. A 18 és 19 July bejegyzései így szólnak: „1 × 0,05 Methylenblau”. A következő napokon ugyanebből a mennyiségből öt, illetve hét adagot tüntettek fel, 22 July napjára pedig kis mennyiségű kinin is megjelenik a feljegyzésben. A lázgörbe, amely a grafikon első felében 37 °C és 39.5 °C között ingadozik, a festék megjelenése után ellaposodik, és a hátralévő három hétben körülbelül 36 °C és 37.5 °C között marad.

A beteg egyike volt annak a két személynek, akiket a tanulmány háziszolgaként, illetve tengerészként ír le. Az általuk kapott vegyület ekkor már tizenöt éve kereskedelmi forgalomban lévő textilfesték volt, és ez a két férfi az elsők között szerepel a feljegyzésekben, akiket egy meghatározott organizmust célzó, teljesen szintetikus gyógyszerrel kezeltek.

Előbb volt a festék

Az első kereskedelmileg sikeres szintetikus festéket William Henry Perkin hozta létre 1856-ban. Perkin tizennyolc éves volt, a húsvéti szünetben otthoni laboratóriumában dolgozott, és kinint próbált szintetizálni. Ehelyett fekete maradékot kapott, amelyet feloldott, és olyan színezőanyagot talált, amely ragyogóan megkötődött a selymen. 1856 August hónapjában szabadalmaztatta, 1857 végére pedig már olyan gyára működött, amely egy londoni selyemfestő üzemet látott el.

1875-ben Adolf von Baeyer egy vörös festéket szintetizált, és az Eos, a hajnal görög neve után eozinnak nevezte el. 1876-ban Heinrich Caro, aki akkor a Badische Anilin- und Soda-Fabrik laboratóriumának igazgatója volt, Baeyerrel együtt fejlesztette ki a metilénkéket pamut festésére szolgáló anilinalapú festékként. Kémiai szerkezetét csak körülbelül kilenc évvel később tisztázták.

Ez az eredet ma is látható az anyag elnevezésében. A „methylene blue” a festékkatalógusból származó kereskedelmi név, nem kémiai leírás. Az általa jelölt vegyület a metiltionínium-klorid, és a név, a só és hidrátjai közötti különbségek azonnal fontossá válnak, amint valaki leméri az anyagot vagy műszaki specifikációt olvas.

A festés jelentette az átjárót

A festéküzemtől a kórházig vezető út a mikroszkópon keresztül haladt, és még a metilénkék létezése előtt kezdődött. Wilhelm Erb volt az első, aki szintetikus festéket alkalmazott vérre: 1865-ben pikrinsavat használt, és egyes vörösvértestek belsejében retikuláris mintázatot figyelt meg.

Paul Ehrlich 1878-as doktori értekezése a szövettani festést a textilfestéssel hasonlította össze, és amellett érvelt, hogy mindkettő kémiai reakció. Robert Koch irányítása alatt, a tuberkulózisbacilussal dolgozva, az anilinfestékeket savas és bázikus osztályokra bontotta, és megállapította, hogy az egyes osztályok a sejt különböző részeit festik meg. 1880-ban a kettőt össze is keverte: telített metilénkék-oldatot öntött savas fukszinba addig, amíg a felülúszó kitisztult. Az eredmény, amelyet neutralen Farbkörpernek, vagyis semleges festéknek nevezett, egy helyett három színt hozott létre, láthatóvá tett korábban nem észlelhető granulumokat a polimorfonukleáris sejtekben, és lehetővé tette az első differenciális leukocitaszám meghatározását. Mivel ezek a granulumok a keverék mindkét komponensét felvették, Ehrlich a neutrofil szót alkotta meg az ezeket hordozó sejtekre.

Két évvel később Koch metilénkéket használt a tuberkulózisbacilus kimutatására, 1883-ban pedig Ehrlich továbbfejlesztette a módszert. 1886-ban más jellegű megfigyelést tett közzé: élő állatokba fecskendezte a festéket, összehasonlította, hogy az egyes szervek milyen mértékben veszik fel, és arra a következtetésre jutott, hogy kifejezett affinitást mutat az agy- és idegszövet iránt. Ezt az affinitást a festék oxidációs-redukciós ciklusának tulajdonította, amelyet az előző évben figyelt meg. Ugyanez a ciklus az oka annak is, hogy a metilénkék-oldat elveszíti a színét, amikor elfogy belőle az oxigén, majd levegő bejutásakor visszanyeri azt. Azok a kísérletek, amelyek először mérték ennek a ciklusnak a következményeit, egy későbbi évtizedhez tartoznak, maga a mechanizmus pedig külön téma a történettől.

A parazita és a lila sejtmag

Alphonse Laveran 1880-ban friss, festetlen vér vizsgálatával találta meg a maláriaparazitát. Ahhoz azonban, hogy szárított kenetben rutinszerűen látható legyen, festésre volt szükség, és a korabeli festékek csak vörös és kék színt hoztak létre.

1888-ban a lengyel patológus, Czesław Cheçinski a savas fukszint eozinra cserélte, így metilénkékből és eozinból álló keveréket hozott létre. Módszerének alapjául egy katona esete szolgált, aki 30 September 1887 napján maláriában halt meg. A vérkenetekben Cheçinski kék, százszorszépszerű alakokat látott, amelyeket ma Plasmodium malariae-ként azonosítunk, valamint sarló alakú formákat, amelyekről ma tudjuk, hogy a Plasmodium falciparum gametocitái. Az eredmény egyszerre vetett véget a betegség két egymással versengő magyarázatának: a miazmaelméletnek, valamint Edwin Klebs és Corrado Tommasi-Crudeli azon állításának, hogy a maláriát baktérium okozza.

A parazita látható volt. A sejtmagja azonban nem, így valódi természete továbbra is kérdéses maradt. Ernst Malachowski, egy breslaui orvos véletlenül, majd tudatosan oldotta meg ezt a problémát. 1889-ben egy preparátumban észrevette a plazmódium sejtmagjának differenciált festődését, de nem tudta reprodukálni. A metilénkék savasítása nem segített. Bóraxszal lúgosítva viszont minden alkalommal létrejött a hatás. A technikát 15 June 1890 napján nyilvánosan bemutatta, még ugyanabban az évben publikálta, majd 1891 August hónapjában részletesebb módszerleírást közölt.

Dmitri Romanowsky 1891 September hónapjában publikálta saját változatát. Legjobb eredményeit egy elhanyagolt, penészes, több mint két hónapos metilénkék-oldatból kapta. Malachowski módszere szándékosan kialakított és saját szavai szerint könnyen reprodukálható volt; Romanowsky megoldása zsákutcának bizonyult, amely egyszer működött. A névadás mégis Romanowskynak jutott, és a vita arról, ki állította elő a sejtmagot láthatóvá tevő lila színt külön történet, saját dokumentumokkal.

**

Ábra:** Guttmann és Ehrlich 1891-es beszámolójának második hőmérsékleti grafikonja. A felső panel 13 és 24 July közötti időszakot, az alsó 25 July és 5 August közötti időszakot mutatja; a margón szereplő bejegyzések megnevezik az adott adagokat, a hőmérséklet pedig a feljegyzés utolsó három hetében a normálérték közelében marad. A beszámoló Krafts, Hempelmann és Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012) számára beszkennelt példánya alapján közölve, PMID 22411634.

Kiderült, hogy az „érlelés” valójában demetilezés

Az 1890-es években senki sem tudta, mit tesz az „érlelés” a metilénkékkel. A válasz az ipari kémiából érkezett. Heinrich August Bernthsen 1883-ban szintetizálta az alapvegyületet, a fenotiazint, 1885-ben megállapította, hogy a metilénkék ebbe a családba tartozik, és ugyanebben az időszakban kimutatta, hogy lúgos körülmények között metilcsoportok válnak le a festékről, létrehozva a ma azúroknak nevezett vegyületeket.

Bernard Nocht 1898-ban és 1899-ben kivonta az aktív frakciót, de csak Rot aus Methylenblau, azaz metilénkékből származó vörös néven tudta megnevezni. Michaelis 1901-ben azure I-ként azonosította. Jenner 1899-ben abszolút metanolt vezetett be a festékcsapadék oldószereként, így szükségtelenné vált a vérkenetek hővel történő fixálása; Leishman és Reuter mindkét fejlesztést egyesítette; Wright 1902-ben egyszerűsített módszert publikált. Giemsa hozzájárulása, szintén 1902-ben, az volt, hogy felhagyott a véletlenszerűen érlelt oldatra való támaszkodással, és helyette ismert festékek kimért mennyiségeit használta. Később nem volt hajlandó közzétenni, hogyan állította elő a tiszta methylene azure-t, és a módszert eladta Dr. Grübler laboratóriumának, amely a terméket azure I néven forgalmazta, és azt állította, hogy kizárólag az ő változata az autentikus Giemsa-festék.

Két világháború véletlenül befejezte ezt a folyamatot. Amikor a német festékek beszerezhetetlenné váltak, Lillie, Roe és Wilcox az amerikai helyettesítő anyagokat vizsgálták, és azt találták, hogy a legjobb festődést három elkülönített komponens adja: tiszta metilénkék, annak bomlásterméke, az azure B, valamint eozin. Ez a három ma is a malária diagnosztizálására használt festék fő összetevője, egy olyan elnevezés alatt, amely ma Malachowski, Wright és Giemsa nevét kapcsolja össze.

**

Ábra:** Plasmodium falciparum gyűrű alakú formái emberi vörösvértestekben, Romanowsky-típusú módszerrel festve. A gyűrűn belüli lila struktúra a kromatin, amelyet Malachowski bóraxszal kezelt metilénkékje tett először láthatóvá. Ernst Hempelmann képe, közkincs.

Egy név, többféle anyag

Az összetevők elkülönítéséhez szükséges évek olyan problémát hagytak maguk után, amely tovább élt magánál a kémiánál. Ralph Lillie 1969-ben határvonalat húzott a biológiai festékek között, amelyeket „a kényes és nagy pontosságot igénylő felhasználással arányos, szigorú specifikációk szerint gyártanak”, valamint a textilszínezésre használt nem biológiai festékek között, amelyek „kevésbé szigorú és kevésbé megterhelő gyártási szabványokat igényelnek”. Mindkét terméktípus ugyanazt a nevet viselte, és a köztük lévő különbség soha nem pusztán fokozati eltérés volt. A pamutra írt specifikáció és a diagnosztikai reagensre írt specifikáció nem felcserélhető, és a textilipari előírás szerint gyártott anyagot nem lenyelésre szánták.

Az azure B erre a legegyértelműbb példa. A metilénkék monodemetilezett formája, önmagában is mérhető farmakológiai aktivitással rendelkezik, és több mint egy évszázadon át ellenőrizetlen összetevőként volt jelen a klinikai metilénkék-készítményekben, mielőtt bárki elkülönítette volna a kettőt. Egy kutatócsoport azt találta, hogy a metilénkék beadása után boncoláskor vett emberi szövetminták 5 to 14 per cent változatlan metilénkéket és 86 to 95 per cent azure B-t tartalmaztak. Az, hogy egy adott készítménynek tartalmaznia kell-e azure B-t, és milyen határérték mellett, specifikációs kérdés, amelyet az azure B mint szennyező és metabolit kutatása tárgyal tovább.

A gyakorlati következmény szintén a specifikációban jelenik meg. A USP-megfelelőség jelenti az utat a piac által kínált legmagasabb tisztasághoz, mert teljes körű, közzétett vizsgálati szabványt jelent, nem egyetlen mérést. Kiterjed az azonosságra, a hatóanyag-tartalomra, az organikus szennyezőkre, köztük az azúrfestékekre, a maradék oldószerekre, az elemi szennyezőkre, az izzítási maradékra, a mikrobiológiai határértékekre és a bakteriális endotoxinokra. Az a tanúsítvány, amely egy nehézfém-vizsgálati eredményt közöl, majd ezt USP-megfelelőségnek nevezi, ennek a listának mindössze egyetlen soráról számolt be.

A Blupreme gyógyszeripari gyártótól szerzi be metilénkékjét, és közzéteszi a teljes analitikai tanúsítványt, a teljes USP-specifikációt vizsgálva, nem csupán a nehézfémeket. Az útmutató az analitikai tanúsítvány olvasásához és annak bemutatása, hogy mit igazol és mit nem igazol a USP megjelölés ismerteti, hogyan ellenőrizhető a dokumentum az állítással szemben.

Mire ad alapot a történet, és mire nem

A történeti folytonosság valós, és hosszabb, mint amit a legtöbb termékoldal sugall. A metilénkéket 1891-ben malária kezelésére használták, 1899-ben agitált pszichózis esetén nyugtatóként számoltak be róla, oldalláncának kémiai vonala pedig a quinacrine, chloroquine, promethazine és chlorpromazine vegyületeken keresztül követhető. Ehrlich 1890-es, Arthur Leppmann-nal közösen írt tanulmánya neuralgiás és reumás fájdalom enyhüléséről számolt be, majd megfontolta, de végül elvetette a festék mentális betegségekben történő vizsgálatát.

Ezek közül egyik sem alapoz meg modern felhasználást. Az 1891-es maláriaeredmény két betegből és egy hőmérsékleti grafikonból állt. Egy molekula hosszú ideje fennálló ismertsége ok a vizsgálatára, nem pedig eredmény. A vegyület gyógyszerként való története és a maláriával kapcsolatos modern klinikai vizsgálatok más kérdésekre adnak választ, mint amelyekre Ehrlich keresett választ, és a végpontokat saját meghatározásuk szerint kell értelmezni.

A feljegyzésekben van egy részlet, amely inkább a jelenhez, mint a múlthoz tartozik. Amikor a kutatók a 2000-es években Burkina Fasóban metilénkékkel végzett maláriavizsgálatokat folytattak, gyógyszerészeti minőségű anyagért kellett versenyezniük, és arról számoltak be, hogy a nyersanyag ára körülbelül százszorosára emelkedett, miután GMP-validálással rendelkezett. Egy festék helyettesíthető volt. Egy gyógyszer nem. A Lillie által 1969-ben meghúzott különbség ugyanaz, amely ma is meghatározza, mi van egy palackban.