Pokusi koji su povezali metilensko modrilo sa staničnim disanjem

Defibrinirana ljudska krv, zagrijavana na 37 °C tijekom tri sata, potroši oko dva posto kisika koji sadržava. Ako se prije inkubacije doda mala količina metilenskog modrila, ista krv potroši oko šezdeset pet posto. U stanicama se ništa nije promijenilo. Promijenila se samo otopina.

Taj podatak potječe iz rada Georgea Harropa i E. S. Guzmana Barrona s Johns Hopkinsa iz 1928. godine i izvor je često ponavljane tvrdnje da metilensko modrilo poboljšava stanično disanje. Tvrdnja nije netočna, ali ima uže značenje nego što se čini.

Što broj u tablici zapravo mjeri

Mjereni ishod bio je utrošak kisika, određen analizom plinova. Harrop i Barron filtrirali su svježe uzetu krv kroz vatu na 10 °C kako bi uklonili bijele krvne stanice, zasitili uzorak kisikom, podijelili ga, jednom dijelu dodali boju i nakon inkubacije analizirali oba dijela. Broj leukocita rijetko je prelazio oko tisuću po kubičnom milimetru. Potrošnja kisika iskazana je kao udio početnog sadržaja kisika u uzorku koji je nestao.

Mjerili su i ugljikov dioksid, no tu im je metoda zadavala poteškoće. Defibrinirana krv tijekom prvog sata inkubacije oslobađala je do dva milimola ugljikova dioksida na 100 mL iz razloga nepovezanih s proučavanom reakcijom, pa su respiracijski kvocijenti dobiveni iz pune krvi bili neupotrebljivi. Samo su isprane stanice u Lockeovoj otopini dale protumačive vrijednosti, koje su se kretale između 0.73 i 0.80, s bojom i bez nje.

Taj detalj nije nevažan. „Disanje” u tim radovima znači izmjenu plinova u zatvorenoj posudi. Razlika između potrošnje kisika i korisne energetske proizvodnje zasebno je razmotrena u članku što vam potrošnja kisika govori, a što ne govori o ATP-u.

Boja je najviše pridonijela ondje gdje su stanice najmanje disale

Zreli eritrociti sisavaca gotovo da nemaju mjerljivu potrošnju kisika. Eritrociti ptica, koji imaju jezgru, imaju je. Harrop i Barron ispitali su obje skupine, a razlika među njima temelj je njihova argumenta.

U uzorcima sisavaca boja je izazvala povećanja od dvadeset do pedeset puta. U guščjoj krvi, čije su stanice već disale, nikad nije više nego udvostručila brzinu. Što je početno disanje bilo veće, to je boja mogla manje pridonijeti.

Isti se obrazac pojavljuje unutar jedne vrste. Ljudski uzorak pacijenta s policitemijom verom, koji je sadržavao nezrele stanice, potrošio je 11.3 posto svojeg kisika bez prisutnosti boje, nasuprot 2.8 posto kod ispranih stanica zdravog darivatelja. Boja je tu vrijednost povećala samo na 63.4 posto, što je bilo šesterostruko ubrzanje, dok su normalne stanice ubrzale gotovo trideset puta. Boja je zrele stanice približila ponašanju nezrelih, upravo kako su autori i opisali njezino djelovanje.

Cijanid je to trebao zaustaviti

Bilo je poznato da cijanid zaustavlja staničnu oksidaciju. Harrop i Barron ipak su ga dodali zajedno s bojom.

Rezultati s goveđom krvlju reprezentativni su. Sadržaj kisika tijekom tri sata pao je s 22.61 na 22.03 volumnih posto bez ikakvih dodataka. Uz metilensko modrilo pao je na 12.84. Uz metilensko modrilo i kalijev cijanid u koncentraciji od jedne pet tisućinke mola po litri pao je na 12.74. Učinak boje u biti je ostao nepromijenjen.

Slika: kontinuirani mikrorespirometrijski zapis ljudskih eritrocita. Strelica označava dodavanje metilenskog modrila. Prije toga krivulja je gotovo ravna; nakon toga ravnomjerno raste. Preuzeto iz rada Harropa i Barrona, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Zaključili su da boja djeluje kao prijenosnik kisika, „osiguravajući tvar koja je nestala iz zrelih eritrocita sisavaca bez jezgre”. Dvije godine poslije Michaelis i Salomon s Rockefellerova instituta dali su tom neslaganju oblik koji je ostao trajno prisutan. Učinak boje bio je ili „slučajno svojstvo boje” ili je boja bila „model neke nepoznate tvari u organizmima”. Ta dvojba nije razriješena. Promijenilo se to što se stanice danas mogu opisati mnogo preciznije.

Ekstrakt jetre učinio je isto

Michaelis i Salomon pokazali su da ekstrakti organa dobiveni hladnom vodom izazivaju istu stimulaciju. Jetra štakora imala je najjači učinak, a slijedili su bubreg, slezena i testis. Mozak, mišić i krvni serum imali su slab učinak ili ga uopće nisu imali.

Zatim su ispitali ekstrakt u prisutnosti ugljikova monoksida. Disanje izazvano ekstraktom ili bojom ostalo je nepromijenjeno u smjesi od 98 posto ugljikova monoksida i 2 posto kisika. Ista plinska smjesa inhibirala je disanje kvasca i eritrocita peradi s jezgrom za otprilike 60 do 80 posto, u skladu s Warburgovim opisom respiracijskog fermenta osjetljivog na ugljikov monoksid. Neidentificirana tvar iz tkiva stoga nije bila Warburgov enzim.

Pritom je odbačeno nekoliko mogućih identiteta te tvari. Reducirani glutation i cistein uzrokovali su samo potrošnju kisika potrebnu za vlastitu oksidaciju. Hardenov i Youngov koenzim isključen je jer ga mišić sadržava najviše, a pokazao je gotovo najslabiji učinak. Keilinov citokrom, nazvan nekoliko godina ranije, naišao je na isto proturječje. Vlastitu pretpostavku da aktivna tvar potječe iz stanične jezgre nazvali su tek pretpostavkom.

Učinak je ovisio o određenim uvjetima

Stanice su morale biti netaknute. Hemoliza destiliranom vodom ili ponovljenim zamrzavanjem ukinula je odgovor i na boju i na ekstrakt, a djelomična hemoliza smanjila ga je razmjerno svojem opsegu.

Bio je potreban i šećer. Glukoza, fruktoza i saharoza podržavale su disanje izazvano bojom; manitol nije. Bez prisutnosti šećera disanja uopće nije bilo, a činilo se da boja pritom oštećuje stanice, pa ga glukoza dodana jedan ili dva sata poslije nije obnovila. Autori su pretpostavili da boja oksidira strukturnu sastavnicu koja je stanici potrebna.

Osvjetljenje je znatno povećalo učinak boje, iako je učinak bio jasan i u mraku. Druge boje koje se mogu reducirati ponašale su se drukčije: toluilensko modrilo imalo je jednak ili jači učinak od metilenskog modrila, dok indigo disulfonat nije učinio gotovo ništa. Nije se pokazala jasna povezanost između oksidacijsko-redukcijskog potencijala boje i veličine njezina učinka, što su autori pripisali membranskoj propusnosti i toksičnosti.

Učinak je pratio fermentaciju, a ne disanje

Barronovo istraživanje iz 1930. prešlo je sa staničnih suspenzija na tkivne rezove normalnih organa štakora i presađenih tumora.

U tkivima bez aerobne glikolize metilensko modrilo nije djelovalo ili je blago smanjivalo potrošnju kisika: u bubregu za oko 14 posto, u gušterači za oko 14 posto, u jetri za oko 5 posto. U tkivima koja fermentiraju u prisutnosti kisika povećavalo je potrošnju: u slezeni za oko 8 posto, u mozgu za oko 13 posto. Povećanja u tumorima kretala su se od oko 27 posto u ljudskom karcinomu dojke do više od 80 posto u Rousovu sarkomu kokoši, približno razmjerno aerobnoj glikolizi svakog tkiva.

Slika: svaka točka predstavlja jednu vrstu tkiva. Vodoravna os prikazuje aerobnu glikolizu; okomita os prikazuje promjenu potrošnje kisika nakon dodavanja metilenskog modrila. Podaci iz rada Barrona, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), tablica 6, PMID 19869777.

Pokus s cijanidom zatim je dao obrnutu sliku. Kada je disanje u tim prethodno neosjetljivim tkivima blokirano cijanidom, a fermentacija došla do izražaja, boja je ponovno povećala potrošnju kisika: u bubregu za oko 59 posto, u jetri za oko 19 posto, u slezeni za oko 286 posto, u testisu za oko 200 posto.

Barron je predložio da bi boja mogla poslužiti kao test fermentacijske sposobnosti stanice ili tkiva te zaključio nagađanjem: uzgoj tumora kroz više generacija u mediju koji sadržava boju možda bi jednog dana mogao trajno učiniti metabolizam tumora sličnim metabolizmu normalnog tkiva. To je bilo istraživačko pitanje zapisano 1930. godine. Nije tvrdnja o liječenju.

Što ti pokusi nisu mogli mjeriti

Godine 1928. i 1930. „disanje” je značilo potrošnju kisika. Adenozin trifosfat prvi je put opisan 1929., a dokaz da izolirani mitohondriji esterificiraju fosfat dok prenose elektrone došao je 1949. Nijedan od ranih radova o metilenskom modrilu nije mogao mjeriti proizvodnju energije i nijedan nije tvrdio da je mjeri.

Stanice su drugi problem. Zreli eritrociti sisavaca ne sadržavaju mitohondrije. Tijekom stadija retikulocita selektivnom autofagijom uklanjaju mitohondrije i ribosome, zbog čega zrela crvena krvna stanica energiju dobiva glikolizom, a o putu pentoza-fosfata ovisi ponajprije zbog NADPH-a, a ne ATP-a. U pokusima iz 1928. nije bilo lanca prijenosa elektrona koji bi se mogao popraviti. Što god je trošilo kisik, radilo je nešto drugo.

Danas je prilično dobro opisano što je to drugo bilo. Metilensko modrilo prima elektrone iz staničnih redukcijskih ekvivalenata i postaje leukometilensko modrilo, koje molekularni kisik ponovno oksidira, čime se ciklus zatvara. U ljudskim crvenim krvnim stanicama korak redukcije provode flavin-reduktaza ovisna o NADPH-u i srodne disulfid-reduktaze. Istraživanje iz 1976. s obilježenom glukozom utvrdilo je da boja stimulira heksoza-monofosfatni put, da učinak pri niskoj koncentraciji ovisi o oksihemoglobinu te da viša koncentracija, 0.1 mM, stvara vodikov peroksid. Reducirana boja u dodiru s kisikom proizvodi peroksid, a ne fosfatne veze.

U mitohondrijima je slika spornija nego što to priznaju popularni sažeci. Jedan smjer istraživanja smatra da boja preuzima elektrone iz područja kompleksa I i predaje ih citokromu c. Drugi je utvrdio da u mitohondrijima mišjeg mozga ne može obnoviti disanje nakon blokade antimicinom te je mjesto prihvata elektrona smjestio na vezno mjesto za ubikinol u kompleksu III. Treći je utvrdio da niske koncentracije povećavaju potrošnju kisika u mirovanju, dok disanje potaknuto ADP-om ostaje nepromijenjeno. Najizravniji zaključak glasi da potrošnja kisika izazvana metilenskim modrilom uopće ne ovisi o oksidativnoj fosforilaciji: nastavila se kada je respiracijski lanac bio inhibiran i u pripravcima u kojima ga nije bilo.

Postoje i izravna mjerenja razlike između tih dviju veličina. U izoliranim mitohondrijima jetre štakora povećavanje koncentracije boje smanjivalo je omjere respiracijske kontrole i izazivalo bubrenje, što su autori opisali kao razdvajanje oksidativne fosforilacije. U perfundiranoj jetri štakora metilensko modrilo povećalo je potrošnju kisika, dok je omjer ATP-a i ADP-a pao.

Klinički podaci nose istu poruku. Methemoglobinemija se liječi približno jednim do dva miligrama metilenskog modrila po kilogramu intravenski, putem redukcijskog puta ovisnog o NADPH-u, a veće doze uzrokuju stanje koje se liječi. Isti pregledni rad napominje da je antidotski učinak najveći u netaknutim eritrocitima, a slabiji kada je prisutna hemoliza, što je nalaz o hemolizi iz 1930. koji se sedamdeset tri godine poslije ponovno pojavljuje u bolničkom kontekstu. Spoj čiji se korisni i štetni učinci nalaze na suprotnim stranama doznog praga nije spoj čiju bi dozu trebalo zaključivati iz mjerenja potrošnje kisika.

Zašto proizvodna serija pripada ovoj raspravi

Harrop i Barron primijetili su nešto što vrijedi ponovno pročitati. Samo metilensko modrilo u spektroskopu stvara vrpcu između dviju karakterističnih vrpci methemoglobina, „što pri površnom promatranju lako može izazvati zabunu”. Boja može oponašati tvar koja se traži.

Isti problem ima i kemijski oblik. Srodni fenotiazin prisutan kao manjinska sastavnica ima vlastito redoks ponašanje, vlastitu propusnost i vlastitu toksičnost. Jedan dokumentirani slučaj jasno pokazuje što je na kocki: u istraživanju jodiranja metilenskog modrila uzorci koji su sadržavali oko 7 do 8 posto Azure B proizveli su uglavnom jodirani Azure B, pa je reakcijom dominirala nečistoća, a ne metilensko modrilo.

Svatko tko metilensko modrilo upotrebljava kao reagens, u laboratoriju, pri bojenju preparata ili u akvariju, radi sa sastojkom nedefiniranih svojstava ako proizvodna serija nije karakterizirana. Srodne tvari, identitet, elementarne nečistoće, ostatna otapala i ostatak nakon žarenja dio su pokusa, a ne samo popratna dokumentacija. Blupreme nabavlja metilensko modrilo od farmaceutskog proizvođača i objavljuje potpuni certifikat analize, uz ispitivanje cjelokupne specifikacije USP, a ne samo teških metala; vodič za čitanje certifikata analize i što oznaka kvalitete prema USP-u potvrđuje, a što ne objašnjavaju kako provjeriti odgovara li dokument tvrdnji.

Broj je bio točan

Pokusi iz 1928. i 1930. bili su pažljivo provedeni, a njihovo središnje opažanje i dalje vrijedi: boja koja se može reducirati može potaknuti stanicu koja jedva diše da troši kisik višestruko brže nego u mirovanju, bez prolaska kroz korak koji cijanid blokira.

Pogreška se pojavljuje poslije, kada se „disanje” tumači u današnjem značenju. Mjerenje izmjene plinova govori vam da su elektroni stigli do kisika. Ne govori vam da je ijedan od njih iskorišten za stvaranje ATP-a, a u stanici bez mitohondrija razlika između tih dviju tvrdnji najveća je moguća. Širi pregled djelovanja metilenskog modrila u stanicama smješta tu razliku u širi okvir, a povijest spoja od boje do lijeka objašnjava kako je tekstilno bojilo uopće dospjelo u te pokuse.