मेथिलीन ब्लू कोशिकाओं में कैसे प्रवेश करता है: अपचयन, पुनः ऑक्सीकरण और झिल्ली में विभाजन

किसी पात्र में एंडोथीलियल कोशिकाओं को मेथिलीन ब्लू ग्रहण करते देखें, तो जो व्याख्या सबसे स्पष्ट लगती है, वही गलत भी है। माध्यम अपना नीला रंग खो देता है और कोशिकाओं में नीले कण दिखाई देने लगते हैं, इसलिए लगता है कि रंजक ने नीले अणु के रूप में झिल्ली पार की होगी। प्रयोग कुछ और बताते हैं। नीला रूप मुश्किल से झिल्ली पार करता है। पार करने वाला रूप रंगहीन होता है, और भीतर जो नीला रंग दिखाई देता है, वह पहुँचने के बाद भीतर ही बनता है।

यह उलटा क्रम महत्वपूर्ण है, क्योंकि इसी से तय होता है कि अभिरंजन क्या बता सकता है और क्या नहीं। नीले कण उस ऑक्सीकृत रंजक का संकेत देते हैं, जिसका दोबारा ऑक्सीकरण हुआ और जो कोशिकांगों में फँस गया। वे कोशिका में मौजूद कुल रंजक का संकेत नहीं देते, अपचयित रंजक की मात्रा नहीं बताते और जैविक प्रभाव नहीं मापते। इसका कारण समझने के लिए तीन चरणों को देखें: सतह पर अपचयन, अपचयित रूप का विसरण, और भीतर पुनः ऑक्सीकरण तथा फँसना।

दोनों रूप अलग-अलग अणुओं जैसा व्यवहार करते हैं

ऑक्सीकृत मेथिलीन ब्लू एक समतल, धनावेशित वलय संरचना है। यह पानी में घुलता है, लगभग 600 से 700 nanometers के बीच प्रकाश का प्रबल अवशोषण करता है और नीला दिखाई देता है। यहाँ आवेश निर्णायक है। आवेशित, जलस्नेही अणु लिपिड झिल्ली से आसानी से नहीं गुजरता, इसलिए वैज्ञानिक साहित्य में सावधानी से इसे झिल्ली के लिए अपेक्षाकृत अपारगम्य कहा जाता है, पूरी तरह अपारगम्य नहीं।

अपचयित मेथिलीन ब्लू, जिसे ल्यूकोमेथिलीन ब्लू कहते हैं, रंगहीन, अनावेशित और वसा में घुलनशील होता है। आवेश हटते ही झिल्ली का अवरोध कम हो जाता है। अपचयित अणु आसानी से झिल्ली के आर-पार विसरित होता है। भीतर अधिक ऑक्सीकारक वातावरण वाले किसी कक्ष में पहुँचने पर वह फिर इलेक्ट्रॉन खो सकता है और नीले, आवेशित, फँसे हुए रूप में लौट सकता है। इसलिए रंजक का रेडॉक्स रसायन ही उसका परिवहन तंत्र भी है। इलेक्ट्रॉनों की संख्या बदलने से पारगम्यता बदल जाती है।

पहले चरण के इलेक्ट्रॉन स्वयं कोशिका से आते हैं। स्तनधारी कोशिकाएँ प्लाज़्मा झिल्ली के आर-पार इलेक्ट्रॉन परिवहन करती हैं। इस प्रक्रिया में कोशिका के भीतर के दाताओं से अपचायक समतुल्य बाहर की ओर, सतह पर स्थित ग्राही अणुओं तक पहुँचते हैं। प्लाज़्मा झिल्ली के आर-पार होने वाली यह गतिविधि कोशिका का सामान्य कार्य है और अधिकांश प्रकार की कोशिकाओं में पाई जाती है। थियाज़ीन रंजकों पर कार्य करने वाला एंडोथीलियल सतह का रिडक्टेज़ एक महत्वपूर्ण पहलू में अन्य रिडक्टेज़ जैसा व्यवहार करता है: वह सायनाइड और एज़ाइड की उन मात्राओं की मौजूदगी में भी काम करता रहता है, जो बाद के चरणों को रोक देती हैं। यही अंतर पूरी प्रक्रिया को समझने का आधार है।

पहले विभाजन का मॉडल आया, और उसने ग्रहण को लगभग समझा दिया

1929 में रॉकफेलर संस्थान की मेरियन इरविन ने एक सरल प्रश्न पूछा। संभव है कि रंजक का प्रवेश केवल पानी और कोशिका की वसायुक्त परतों के बीच विभाजन का परिणाम हो, और प्रयोगशाला में क्लोरोफॉर्म की परत उन वसायुक्त परतों का प्रतिनिधित्व कर सके। अपने स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक प्रवेश अध्ययनों में उन्होंने रंजक के जलीय विलयनों को क्लोरोफॉर्म के साथ हिलाया और तुलना की कि कार्बनिक प्रावस्था में क्या गया और जीवित शैवाल कोशिकाओं में क्या प्रवेश किया।

उस काम के दो निष्कर्ष आज भी ध्यान देने योग्य हैं। पहला, व्यावसायिक मेथिलीन ब्लू विलयनों में ट्राइमेथिल थायोनिन मौजूद था, जिसे अब Azure B कहा जाता है। यह अशुद्धि स्वयं मेथिलीन ब्लू से अधिक तेजी से प्रवेश करती थी, विशेष रूप से क्षारीय pH पर, जहाँ लिपिड में घुलनशील मुक्त क्षार रूप प्रमुख होता है। मेथिलीन ब्लू का कुछ कथित प्रवेश वास्तव में Azure B का चयनात्मक प्रवेश था। दूसरा, pH आयनीकरण की अवस्था निर्धारित करके परिणाम तय करता था, और क्षतिग्रस्त कोशिकाओं में अक्षुण्ण कोशिकाओं की तुलना में कहीं अधिक रंजक प्रवेश करता था। विभाजन गुणांक और आवेश की अवस्था यह नियंत्रित करते थे कि कृत्रिम प्रणाली और जीवित कोशिका, दोनों में कितना अवशोषण होगा। दोनों की समानता ने इस विचार का समर्थन किया कि कोशिका की सीमा में गैर-जलीय परतें होती हैं।

लिपिड और आयनीकरण के बारे में यह मॉडल अपने समय से आगे था। लेकिन यह उस रंजक के बीच अंतर नहीं कर सकता था जो अपने मूल रूप में विभाजित होता है और उस रंजक के बीच जिसका सतह पर रासायनिक रूपांतरण होता है, जो बदले हुए रूप में झिल्ली पार करता है और भीतर फिर अपने पुराने रूप में लौट जाता है। इस अंतर को स्पष्ट करने के लिए एक अलग प्रयोग की आवश्यकता थी। वह सत्तर वर्ष बाद फेफड़ों के एंडोथीलियम में किया गया।

बाहर अपचयन, भीतर फँसना

मर्कर और उनके सहयोगियों ने संवर्धित गोवंशीय फुफ्फुसीय धमनी की एंडोथीलियल कोशिकाओं पर काम किया और तीन चरणों का क्रम प्रस्तावित किया: ऑक्सीकृत रंजक कोशिका की सतह पर अपचयित होकर अपने रंगहीन, लिपिडस्नेही रूप में बदलता है; अपचयित रूप भीतर विसरित होता है; और कोशिका के भीतर पुनः ऑक्सीकरण से झिल्ली के लिए अपारगम्य ऑक्सीकृत रूप फिर बनता है, जो जमा होता जाता है। उनके एंडोथीलियल कोशिकाओं द्वारा थियाज़ीन ग्रहण के अध्ययन ने विशिष्ट चरणों को बाधित करके इस क्रम की जाँच की।

पहला साधन फेरिसायनाइड था, जो इलेक्ट्रॉन ग्राही है और कोशिका में प्रवेश नहीं कर सकता। जब सतह के एंज़ाइम कोशिका के बाहर नीले रंजक को अपचयित करके रंगहीन रूप में बदलते हैं, तो फेरिसायनाइड वे इलेक्ट्रॉन वापस ले सकता है। इससे रंजक के झिल्ली पार करने से पहले ही माध्यम में नीला रंजक फिर बन जाता है। जब तक फेरिसायनाइड अधिक मात्रा में मौजूद रहा (10 micromolar रंजक के मुकाबले 50 से 500 micromolar फेरिसायनाइड), रंजक का ग्रहण लगभग रुक गया। फेरिसायनाइड के पूरी तरह खपने के बाद ही ग्रहण अपनी सामान्य दर पर फिर शुरू हुआ। अभिक्रिया की दरों ने दूसरे तरीके से भी यही बात बताई। फेरिसायनाइड लगभग स्थिर दर से कम हुआ, जो इस व्याख्या के अनुरूप था कि सतह पर अपचयन का स्थिर प्रवाह बार-बार इस्तेमाल हो सकने वाले मध्यस्थ को इलेक्ट्रॉन दे रहा था। वहीं, कोशिका के बाहर का रंजक अपनी उपलब्ध मात्रा घटने के साथ घातांकीय रूप से कम हुआ। स्थिर प्रवाह और घटते रंजक भंडार का अर्थ है कि फेरिसायनाइड का संकेत निरंतर अपचयन को दर्शाता है, विलयन से बाहर जा रहे रंजक अणुओं को नहीं।

दूसरे साधन ने झिल्ली पार करने का चरण पूरी तरह हटा दिया। समूह ने निकट संबंधी थियाज़ीन रंजक टोल्यूडीन ब्लू O को एक बड़ी पॉलीएक्रिलामाइड शृंखला से जोड़ दिया। यह शृंखला इतनी बड़ी थी कि किसी भी ऑक्सीकरण अवस्था में कोशिका में प्रवेश नहीं कर सकती थी। फिर भी कोशिकाओं ने उससे जुड़े रंजक को अपचयित किया। इसलिए अपचयन के लिए कोशिका के भीतर पहुँचने की आवश्यकता नहीं है। यह तंत्र सतह पर उपलब्ध है या उससे विद्युत रूप से जुड़ा हुआ है।

इसके बाद वह अंतर सामने आया, जिस पर शोधपत्र का शीर्षक आधारित है। 2 millimolar पर सायनाइड और एज़ाइड ने रंजक के संचय को बहुत घटा दिया। सूक्ष्मदर्शी में, सामान्यतः केंद्रक के चारों ओर दिखाई देने वाले गहरे नीले और बैंगनी समावेशन लगभग गायब हो गए। फिर भी किसी अवरोधक ने कोशिका के बाहर होने वाले अपचयन को धीमा नहीं किया: फेरिसायनाइड का चक्रीय रूपांतरण बिना कमी के चलता रहा और कोशिका में प्रवेश न कर सकने वाला बहुलक भी अपचयित होता रहा। अवरोध बाद के चरण में था। सायनाइड और एज़ाइड कोशिका के भीतर पुनः ऑक्सीकरण और रंजक को अलग कक्षों में रोककर रखने की प्रक्रिया को रोक रहे थे, सतह पर अपचयन को नहीं। कोशिकाओं की जीवित अवस्था की जाँच ने भी इस व्याख्या का समर्थन किया। इन उपचारों के दौरान कोशिकाओं ने अपने कोशिकाद्रव्य के सूचक एंज़ाइम लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज़ को भीतर बनाए रखा। इसलिए ग्रहण में कमी केवल विषाक्तता या झिल्ली फटने का परिणाम नहीं थी।

शोधपत्र की एक सावधानी आज भी लागू होती है। नीले समावेशन केंद्रक के आसपास थे, उसके भीतर नहीं। यह कोशिका के भीतर के कोशिकांगों में ऑक्सीकरण होने के अनुरूप था, लेकिन अध्ययन ने यह नहीं पहचाना कि वे कौन-से कोशिकांग थे। अन्य प्रकार की कोशिकाओं में ऐसे ही प्रतिरूपों को कमजोर प्रमाण के आधार पर लाइसोसोम से संबंधित कहा गया था। रंजक के फँसने को स्थापित निष्कर्ष मानें और उसके सटीक स्थान को अनंतिम। इलेक्ट्रॉन आगे कहाँ जाते हैं, यह जानने वाले पाठक माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन और रेडॉक्स प्रक्रियाओं तथा प्रवेश मार्ग के अनुसार अवशोषण और वितरण के व्यापक विवरण को आगे पढ़ सकते हैं।

अभिरंजन संपर्क का माप नहीं है

तीसरा अध्ययन दिखाता है कि ग्रहण की इस प्रक्रिया को किसी जैविक माप के साथ देखने पर क्या होता है। स्कॉट और उनके सहयोगियों ने पाया कि वलयाकार शर्करा संरचना मिथाइल बीटा साइक्लोडेक्स्ट्रिन सीधे मेथिलीन ब्लू से बँधती है। समावेशन संकुल के लिए साहचर्य स्थिरांक लगभग 310 per molar था, जबकि रंजक के द्वितयीकरण के लिए यह लगभग 5846 per molar था। L929 फाइब्रोब्लास्ट में इस बंधन ने कोशिका के अभिरंजन और ग्लूकोज़ ग्रहण की उत्तेजना, दोनों को रोक दिया: साइक्लोडेक्स्ट्रिन के साथ पहले से ऊष्मायन करने पर नीला अभिरंजन नहीं हुआ, और इसे बाद में जोड़ने पर रंग हटने की प्रक्रिया तेज हो गई। जैसे-जैसे कोशिकाओं से नीला प्रकाशीय संकेत घटा, सक्रिय हुआ ग्लूकोज़ परिवहन भी लगभग उसी क्रम में कम होता गया।

लेखकों ने इस सहसंबंध की व्याख्या इस रूप में की कि यह लंबे समय तक रहने वाले ऑक्सीडेटिव तनाव के तंत्र की तुलना में रंजक और ग्लूकोज़ परिवाहक को सक्रिय करने वाले मार्ग के किसी प्रोटीन के बीच सीधे संपर्क का अधिक समर्थन करता है। यह अनुमान उचित है, लेकिन इसकी सीमाएँ हैं। प्रयोग उस प्रोटीन की पहचान नहीं करता, स्वयं परिवाहक से बंधन नहीं दिखाता, और रंग हटने तथा प्रभाव कम होने के बीच सहसंबंध हर रेडॉक्स-मध्यस्थित मार्ग को खारिज नहीं कर सकता।

इससे मिलने वाली स्थायी सीख मापन के बारे में है। प्रकाशीय अभिरंजन दिखाई देने वाले, ऑक्सीकृत, कोशिका से संबद्ध रंजक का संकेत देता है। रंगहीन अपचयित रंजक की पूरी मात्रा इससे छूट जाती है। इसलिए हल्के रंग वाली कोशिका में भी रंजक के समतुल्य मौजूद हो सकते हैं, और गहरे रंग से अभिरंजित कोशिका कुल ऊतक संपर्क या प्रभाव के परिमाण के बजाय फँसे हुए ऑक्सीकृत रंजक का संकेत देती है। यही सावधानी बड़े स्तर पर भी लागू होती है: अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं के अभिरंजन की तुलना करना, या किसी गहरे रंग वाले ऊतक खंड को अधिक संपर्क का प्रमाण मानना, पात्र में देखी गई प्रक्रिया की शुरुआती गलत व्याख्या को दोहराता है। ग्रहण अपचयन, विसरण और पुनः ऑक्सीकरण का चक्र है। नीले रूप का कोई भी एक क्षणिक दृश्य इस चक्र का केवल एक भाग दिखाता है। प्रयोगशाला में अभिरंजन और रंजक के इस्तेमाल तथा खुराक और संपर्क संबंधी दावों की व्याख्या के लिए व्यावहारिक निष्कर्ष सीधे इसी से निकलते हैं।