מתילן כחול ופרופטוזיס: ברזל, חמצון פראוקסידי של ליפידים ומוות תאי

פרופטוזיס הוא מוות תאי הנגרם מנזק לממברנה. שומנים רב־בלתי־רוויים בממברנות מתחמצנים בתגובת שרשרת, הממברנה כושלת והתא מת. ברזל נחוץ לתהליך הכימי הזה. המשפט הזה ממצה את הרעיון כולו, וכל מה שמופיע במאמר הזה הוא בדיקה של חלק ממנו.

השאלה כאן מצומצמת יותר: מה מתילן כחול עושה לשרשרת הזאת בניסויים בתאים, ומה התוצאה הזאת מראה בפועל. התשובה הקצרה היא שבשני מחקרי מעבדה, מתילן כחול בריכוזים ננומולריים הפחית חמצון פראוקסידי של ליפידים במיטוכונדריה ושמר על התאים בחיים לאחר חשיפה לגורמים שאחרת גורמים לפרופטוזיס. התשובה הארוכה חשובה יותר, משום שכל חוליה בשרשרת נבדקה באמצעות התערבות אחרת, ולכל התערבות יש מגבלות.

פרופטוזיס בפסקה אחת

לפוספוליפיד בממברנה הנושא זנב של חומצת שומן רב־בלתי־רוויה יש נקודת תורפה: אטומי מימן שקל לחטוף. ברגע שרדיקל חוטף אחד מהם, חמצן נקשר לליפיד, נוצר רדיקל פראוקסיל ליפידי, והרדיקל הזה חוטף מימן מהליפיד הבא. התגובה מתפשטת לאורך הממברנה, אלא אם משהו עוצר אותה.

מנגנון העצירה העיקרי הוא אנזים בשם GPX4, המשתמש בגלוטתיון כדי לחזר פראוקסידים ליפידיים לאלכוהולים ליפידיים שאינם מזיקים. גורמים המשמשים להשראת התהליך במעבדה תוקפים את ההגנה הזאת בנקודות מוגדרות. ארסטין חוסם את הכנסת הציסטין דרך מערכת xc-minus, וכך מונע מהתא את הציסטאין הדרוש לסינתזת גלוטתיון. בותיונין סולפוקסימין חוסם את סינתזת הגלוטתיון ישירות. RSL3 מעכב את GPX4 עצמו. כל השלושה משאירים פראוקסידים שלא סולקו, אך הם עושים זאת בשלבים שונים, ולכן תוצאה עם גורם אחד אינה ניתנת להכללה אוטומטית לאחרים.

פרופטוזיס שונה מאפופטוזיס בתכונות המגדירות אותו. אין בו מפל הפעלה של קספאזות ואין גופיפים אפופטוטיים. קושרי ברזל כגון דפרוקסאמין וחומרים הלוכדים רדיקלים כגון פרוסטטין-1 מדכאים אותו, וזהו המבחן התפעולי שבו משתמשים חוקרים כדי להגדיר מוות כפרופטוטי ולא כנקרוטי בלבד. התמונה הרחבה של מסלולי המוות התאי המבוקר מספקת הקשר להבחנה הזאת, והאופן שבו תאים מטפלים בברזל לבילי מסביר מדוע קישור ברזל הוא ביקורת כה מכרעת.

היכן משתלבות המיטוכונדריות, ומדוע הדבר היה שנוי במחלוקת

מחקרים מוקדמים דיווחו שתאים ללא DNA מיטוכונדריאלי עדיין עוברים פרופטוזיס, דבר שהצביע על כך שמיטוכונדריות אינן הכרחיות. מחקרים מאוחרים יותר מצאו שהפחתת מספר המיטוכונדריות, או חסימת הנשימה התאית, עשויות לדכא פרופטוזיס הנגרם ממחסור בציסטאין, אך לא כזה הנגרם מעיכוב ישיר של GPX4. שתי התוצאות יכולות להיות נכונות אם תרומת המיטוכונדריות תלויה בגורם המשרה, בסוג התא ובמיקום שבו מתרחש החמצון הפראוקסידי המכריע.

המחקר שעליו נשען המאמר הזה ניגש למחלוקת באמצעות גשושית ייעודית למדור תאי מסוים. MitoCLox הוא גרסה ממוקדת־מיטוכונדריה של גשושית המדווחת על חמצון פראוקסידי של ליפידים: הוא משנה את הפלואורסצנציה כשהוא פוגש רדיקלי פראוקסיל ליפידיים בתוך המיטוכונדריות. בפיברובלסטים שטופלו בארסטין, חמצון הגשושית המיטוכונדריאלית הופיע בתאים שעדיין היו חיים, לפני מותם, והיה לא אחיד באוכלוסיית התאים. לתזמון הזה יש חשיבות. חמצון פראוקסידי שקודם למוות הוא גורם סיבתי אפשרי. חמצון פראוקסידי שנמדד רק בתאים מתים הוא שריד של התהליך. מדריך נלווה על בדיקות חמצון פראוקסידי של ליפידים ומה כל גשושית מדווחת מסביר מדוע מיקום הגשושית קובע את משמעות האות.

אותו דפוס הופיע במודל שני. פיברובלסטים ממטופל עם נוירופתיה אופטית תורשתית על שם לבר, הנושאים מוטציה בקומפלקס I ועקה חמצונית גבוהה יותר במצב הבסיסי, מתו בפרופטוזיס כאשר הגלוטתיון דולדל, ואילו פיברובלסטים ששימשו כביקורת היו עמידים. גם כאן חמצון הגשושית המיטוכונדריאלית הופיע קודם. הפרטים מופיעים במחקר בפיברובלסטים על חמצון פראוקסידי של ליפידים במיטוכונדריה בפרופטוזיס.

מה שינה מתילן כחול בניסויים האלה

מתילן כחול הוא נשא חמצון־חיזור. צורתו המחומצנת מקבלת אלקטרונים מתהליכים כימיים הקשורים ל-NADH בקומפלקס I, וצורתו המחוזרת מוסרת אותם לציטוכרום c, שמעביר אותם לקומפלקס IV. כך נוצר מעקף חלקי סביב המקטע בשרשרת שבו אלקטרונים דולפים בדרך כלל אל החמצן ויוצרים סופראוקסיד. קוראים המעוניינים בתמונה המלאה של העברת האלקטרונים יכולים להתחיל בכיצד מתילן כחול מעביר אלקטרונים דרך המיטוכונדריות.

בפיברובלסטים של הריאה שטופלו בארסטין, מתילן כחול בריכוז של 250 ננומולר שמר על חיות התאים במדידת הישרדות תאית, לצד נוגדי החמצון ממוקדי־המיטוכונדריה SkQ1 ו-MitoTEMPO. הביקורות מגדירות את גבולות הטענה. גם פרוסטטין-1, אלפא־טוקופרול ודפרוקסאמין הגנו על התאים, דבר המאשר שהמוות היה פרופטוטי. האנלוג של SkQ1 ללא קבוצה נוגדת חמצון לא הגן, ממצא המצביע על כימיית חמצון־חיזור ולא על הצטברות בלתי־ספציפית. ההגנה נחלשה מעל כ-200 ננומולר של SkQ1, בהתאם לפעילות הפרו־חמצונית המוכרת של נוגדי חמצון מסוג קינון בריכוזים גבוהים יותר. גם למתילן כחול יש התנהגות דו־צדדית כזאת כתלות במינון: הוא מגן בריכוזים ננומולריים נמוכים בצלחות האלה, אך מסוגל לייצר מי חמצן באמצעות מחזורי חמצון־חיזור כאשר ריכוזו עולה או כשהוא נחשף להארה חזקה. הקשר כזה של מינון נידון במיני חמצן תגובתיים במיטוכונדריות.

הניסויים במיטוכונדריות מבודדות הפרידו לאחר מכן בין מקורות ה-ROS. בנוכחות ברזל דו־ערכי, מצעים המזינים את קומפלקס I יחד עם רוטנון עודדו חמצון של הגשושית. רוטנון חוסם את השרשרת במורד הזרם מאתר הפלבין, ולכן נשאים במעלה הזרם נשארים מחוזרים ודולפים אלקטרונים אל החמצן מהפלבין הפונה אל המטריקס. מצעים המזינים את קומפלקס III יחד עם אנטימיצין A יצרו כמות רבה של מי חמצן, אך לא הניעו חמצון פראוקסידי של ליפידים. אותו אות ROS כולל, מיקום אחר, תוצאה אחרת. הן SkQ1 והן מתילן כחול דיכאו את החמצון הפראוקסידי המונע על ידי קומפלקס I בלי לדכא את ייצור מי החמצן עצמו, דבר הממקם את פעולתם לאחר היווצרות ה-ROS, בשלב החמצון הפראוקסידי של הליפידים.

זרוע עומס הברזל והרמז מליפופוסצין

מחקר שני בחן את השאלה מצד הברזל. תאי שריר לב מסוג H9c2 שנחשפו לציטראט ברזל תלת־ערכי ואמוניום בריכוז תת־מילימולרי פיתחו ROS במיטוכונדריה, חמצון פראוקסידי של ליפידים במיטוכונדריה ולאחר מכן פרופטוזיס, ואחריו הצטברות של פיגמנט דמוי ליפופוסצין בתוך 24 שעות. ליפופוסצין הוא שארית המכילה ברזל ובעלת פלואורסצנציה עצמית של ליפידים וחלבונים מחומצנים, המצטברת עם הגיל. הופעתו המהירה כאן קושרת חמצון פראוקסידי חריף המונע על ידי ברזל לסמן הזדקנות קלאסי. הן מתילן כחול בריכוזים ננומולריים והן SkQ1 מנעו את החמצון הפראוקסידי, את המוות ואת הצטברות הפיגמנט. מיטוכונדריות לבביות מבודדות אישרו את הדפוס: רוטנון יחד עם ברזל דו־ערכי הניעו חמצון פראוקסידי ואות דמוי פיגמנט, ושני החומרים חסמו זאת. הרצף המלא מתואר במחקר על עומס ברזל בתאי שריר לב מסוג H9c2. היבט הפיגמנט שייך לדיון על ליפופוסצין וסמני הזדקנות תאית.

מה בדיקות הישרדות תאים אינן מראות

מדד חיות כגון CellTiterBlue מדווח כמה תאים בצלחת נשארים פעילים מבחינה מטבולית לאחר חשיפה לגורם משרה ולחומר מועמד להגנה. זוהי בדיקה של מנגנון במערכת מוגדרת. אין זו תוצאה טיפולית. באף אחד מהניסויים האלה לא ניתן מינון למטופל, לא נמדד מדד תוצאה של מחלה ולא נקבע חלון טיפולי בגוף.

ראוי לציין במפורש ארבע מגבלות. ראשית, מגוון סוגי התאים מצומצם: פיברובלסטים מותמרים של הריאה, פיברובלסטים ראשוניים של העור ובהם קו תאים אחד עם מחלה מיטוכונדריאלית, וקו תאי שריר לב של חולדה, לצד מיטוכונדריות מבודדות מלב חולדה. הרגישות השתנתה בין קווי התאים, וקו ה-LHON נבחר בשל פגיעותו החריגה. שנית, הגורמים המשרים הם תנאי קיצון מעבדתיים: חסימה מלאה של הובלה או של סינתזה, ועומסי ברזל ששום רקמה לא הייתה נחשפת אליהם באופן חריף. שלישית, אי אפשר להמיר ריכוז באמצעות הכפלה. ריכוז ננומולרי במדיום תרבית אינו מינון לאדם, ופיזור המתילן הכחול, חיזורו לצורתו חסרת הצבע בדם וברקמות, חשיפה לאור ופוטנציאל הממברנה — כולם מבדילים בין צלחת מעבדה לאדם. רביעית, הגשושיות מדווחות על המדור שלהן. חמצון MitoCLox מראה שנוצרו רדיקלים ליפידיים במיטוכונדריה; הוא אינו מראה שקריעת ממברנת התא, שהיא כנראה האירוע הסופי, נמנעה ישירות ולא בעקבות התערבות במעלה הזרם.

לכן הטענה המדויקת היא זו: במודלים האלה, ROS שמקורם בקומפלקס I יחד עם ברזל מניעים חמצון פראוקסידי של ליפידים במיטוכונדריה שקודם לפרופטוזיס, ומתילן כחול בריכוזים נמוכים קוטע את המקטע הזה. כל טענה מעבר למקטע הזה דורשת ניסויים אחרים בבעלי חיים, ולאחר מכן בבני אדם.