מדוע הבליעה של מתילן כחול משתנה עם הריכוז

קחו בקבוק אחד של תמיסת אם של מתילן כחול ומזגו לשתי כוסות. מלאו את הראשונה מתמיסת האם ואת השנייה מתמיסה שדוללה פי עשרה. הכוס השנייה בהירה יותר, כצפוי. התבוננו מקרוב ותגלו שמשהו נוסף השתנה. הגוון השתנה. תמיסה אחת נוטה לכחול שמיים צלול, והאחרת לכחול עם נגיעה סגולה. הדילול עשה יותר מאשר להפחית את העוצמה. הוא שינה איזה צורון כימי אחראי לרוב הבליעה.

הרעיון שמאחורי השינוי פשוט. מתילן כחול מומס אינו צורון יחיד. קטיון הצבען הבודד, המכונה מונומר, יכול להיערם פנים אל פנים עם קטיון שני וליצור דימר, ודימרים יכולים להתפתח לאגרגטים גדולים יותר. לכל צורה ספקטרום בליעה משלה. מה שהספקטרופוטומטר מדווח הוא סכום התרומות של התערובת הנמצאת באותה קיווטה, באותם תנאים. שנו את התערובת והספקטרום ישתנה, גם כאשר תכולת הצבען הכוללת משתנה לפי יחס דילול פשוט.

מונומר ודימר בולעים באופן שונה

דמיינו את המונומר ככרטיס שטוח שמטען חיובי מפוזר על פני מערכת הטבעות שלו. שני כרטיסים כאלה יכולים להיצמד פנים אל פנים. המטענים החיוביים דוחים זה את זה, אך המשטחים הארומטיים השטוחים מושכים זה את זה באמצעות אינטראקציות ערימה, והמים ויוני הנגד שסביבם מסככים את הדחייה. התוצאה היא זוג קשור בעל מצבים אלקטרוניים משותפים. המעברים המותרים שלו נמצאים באנרגיה גבוהה יותר ממעבר המונומר, ולכן פס הדימר מופיע באורך גל קצר יותר מפס המונומר, ואגרגטים גדולים יותר תורמים כתף נוספת לכיוון הצד הכחול של הספקטרום.

בריכוז נמוך מאוד במים נקיים, המונומרים שולטים ופס הבליעה באורך הגל הארוך דומיננטי. ככל שהריכוז הכולל עולה, חלקה של הצורה הזוגית גדל, והפס באורך הגל הקצר מתחזק ביחס לראשון. לכן היחס בין שני הפסים מעיד על הרכב התערובת, ולא ישירות על הריכוז הכולל. מדידה באורך גל יחיד אינה יכולה להפריד בין השניים ללא הנחה לגבי הצורה הנוכחת.

זו הסיבה שספקטרומי ייחוס חייבים תמיד להיות מלווים בתנאים. מקור הייחוס הספקטרלי למתילן כחול מציג בטבלה את מיקומי הפסים לצד הממס, רקע המלחים, ה־pH, הטמפרטורה וטווח הריכוזים שבהם התקבלו. ציטוט של שיא ללא התנאים האלה משאיר את המספר ללא הגדרה מספקת. שתי מעבדות יכולות לדווח בצדק על ספקטרומים שונים של אותו צבען, משום שמדדו תערובות שונות.

מה מזיז את שיווי המשקל

הריכוז הוא הגורם המרכזי. יצירת דימר מחייבת מפגש בין שני מונומרים, ולכן חלקו גדל מהר יותר מקצב ליניארי ביחס לכמות הצבען הכוללת. קבועי הדימריזציה המדווחים במים הם בסדר גודל של אלפים ל־molar סמוך לטמפרטורת החדר, ולכן חלקו של הדימר עולה בחדות בטווח ה־micromolar. התאמה גלובלית רחבה, שכללה ריכוזי צבען מ־micromolar עד millimolar, מצאה תרומה שאינה אפס של טטרמר כבר מתחת ל־34 micromolar. זהו סימן אזהרה מפני הסתמכות על התאמה לשני צורונים בלבד בריכוזים של עשרות micromolar. השברים המדויקים תלויים בתווך, ולכן המאמר הזה מתאר מגמות ולא מציע טבלת המרה אוניברסלית.

מלח הוא הגורם השני. יונים מומסים מסככים את הדחייה בין שני קטיונים, ולכן הוספת נתרן כלורי ואלקטרוליטים דומים דוחפת את התערובת לכיוון דימרים ואגרגטים באותו ריכוז צבען. ההשפעה נראית במחקרים על אגרגציה של מתילן כחול בתמיסות מלח ובתווכים מימיים, שבהם נמדד צבען בריכוזים מכ־1 micromolar עד 3.4 millimolar, בריכוזי נתרן כלורי מ־0 עד 0.15 molar. באותה התאמה, שבר הטטרמר הגיע לכ־0.93 בקצה שבו גם ריכוז הצבען וגם ריכוז המלח היו גבוהים. לכן ספקטרום שנמדד במים וספקטרום שנמדד בתמיסת מלח פיזיולוגית אינם תקני ייחוס שניתן להחליף ביניהם.

הטמפרטורה פועלת בכיוון ההפוך. הערימה משחררת מים קשורים, והתנועה התרמית פועלת נגדה, ולכן חימום תמיסה מפרק בדרך כלל חלק מהדימרים בחזרה למונומרים, בעוד שקירור מעודד התאגדות. אנתלפיית הדיסוציאציה שהתקבלה בהתאמה היא שלילית, כ־מינוס 30 kilojoules per mole בטווח של 282 עד 333 kelvin, דבר המאשר התאגדות אקסותרמית. דגימה קרה שנמדדת מיד לאחר הוצאתה מקירור עשויה להיראות מאוגדת יותר מאותה דגימה לאחר שהגיעה לשיווי משקל בטמפרטורת החדר.

הממס קובע את נקודת המוצא. מים, בזכות האפקט ההידרופובי החזק שלהם, מעודדים קטיוני צבען שטוחים להיערם. כוהלים כמו אתנול ומתנול ממסים טוב יותר את הטבעות ומפרקים אגרגטים, ולכן באותו ריכוז צבען התמיסה באתנול נראית מונומרית יותר מזו שבמים. ממסים נלווים אפרוטיים פועלים באופן דומה: בתערובות של מים ו־DMSO בטמפרטורה של 293 kelvin, הוספת DMSO דיכאה דימריזציה, ממצא המצביע על מבנה המים כגורם מניע לערימה. חומרים פעילי שטח מחייבים זהירות בשני הכיוונים. מעל לריכוז המיצלות הקריטי שלהם, מיצלות יכולות להמיס מונומרים בנפרד ולהחזיר ספקטרום דמוי מונומר. מתחת לנקודה הזו, חומר פעיל שטח בעל מטען נגדי עשוי דווקא לעודד ערימה: בריכוז צבען של 100 micromolar, פולימריזציה המונעת על ידי SDS הגיעה לשיא סמוך ל־4 millimolar של SDS, בערך מחצית מריכוז היווצרות המיצלות, לפני שהתרחשה חלוקה מחדש בריכוזים גבוהים יותר של חומר פעיל השטח. מחקר על השפעות של צבען–ממס ושל תווכים מאורגנים על ספקטרומי מתילן כחול ממחיש עד כמה הסביבה המולקולרית המיידית, ולא רק הריכוז הכולל בתמיסה, קובעת את הפסים הנצפים.

ה־pH חשוב בעיקר בקצוות. בטווח הקרוב לניטרלי המשמש ברוב עבודת המעבדה, מתילן כחול נשאר בצורתו הקטיונית הכחולה המוכרת, והאגרגציה היא הגורם הדומיננטי בהתנהגות הספקטרלית. חומצה או בסיס חזקים, כימיית חמצון־חיזור שמייצרת את צורת הלאוקו חסרת הצבע, או קישור לחלבונים ולחלקיקים, מוסיפים כל אחד מצבים מעבר לזוג מונומר–דימר. כאשר ספקטרום משתנה לאחר הוספת בופר, בדקו אם הרכב הבופר כולל מלח ורכיבים קושרים לפני שתייחסו הכול ל־pH בלבד. מקור הייחוס לכימיה ולפרוטונציה מפריד בין שאלות הזהות האלה לבין שאלת האגרגציה הנדונה כאן.

מדוע הקו הישר של בר–למברט מתעקם

יחס בר–למברט קובע שהבליעה שווה למקדם הבליעה כפול הריכוז כפול אורך המסלול האופטי. זהו חוק ספירה. הוא מניח שהעצמים הנספרים נשארים זהים כאשר מספרם משתנה: צורון בולע יחיד, ספקטרום קבוע, ללא שינוי כימי עם הריכוז, אור מדידה מונוכרומטי, ללא פיזור או פליטה מחדש, ואור שאכן עובר לאורך המסלול המוצהר.

אגרגציה מפרה את ההנחה הראשונה. מבחינה פורמלית, הבליעה הכוללת נשארת סכום התרומות של הצורונים: אורך המסלול כפול מקדם הבליעה של כל צורון כפול ריכוזו של אותו צורון. כל צורון מציית לחוק. התערובת אינה מצייתת לו, משום שריכוזי הצורונים הם פונקציות לא־ליניאריות של כמות הצבען הכוללת. לכן עקומת כיול של הבליעה בפס המונומר כתלות בריכוז הצבען הכולל מתחילה כקו ישר בגבול הריכוזים הנמוכים ומתעקמת כלפי מטה ככל שהריכוז עולה, משום שכל תוספת מביאה עמה פחות מונומר באופן יחסי. עקומה הנמדדת בפס הדימר מתעקמת בכיוון ההפוך. מחקרי האגרגציה מצביעים בדיוק על המנגנון הזה כמקור לסטיות הנצפות מחוק למברט–בר. התאמת קו ישר לאזור המעוקם וביצוע אקסטרפולציה ממנו הם הטעות הנפוצה. הקו תקף רק בטווח ובמטריצה שבהם נבנה.

דילול יוצר מלכודת קשורה. דילול תמיסת אם מרוכזת כדי להגיע לטווח המדידה של המכשיר אינו משמר את יחס הצורונים. התמיסה המדוללת בקיווטה מגיעה מחדש לשיווי משקל הנוטה לכיוון המונומר, ולכן הספקטרום שלה מתאר נכון את הדגימה המדוללת אך מתאר באופן שגוי את תמיסת האם. חישוב לאחור של ספקטרום תמיסת האם באמצעות הגדלה יחסית של ערכי הבליעה משחזר את אומדן התכולה הכוללת רק אם הכיול כבר מביא בחשבון את השינוי הזה. הוא לעולם אינו משחזר את צורת הפסים המקורית. מי שמשווה ספקטרום של תמיסה מרוכזת לייחוס מדולל משווה שתי תערובות שונות.

אורך המסלול האופטי הוא חלק מהתוצאה

הבליעה גדלה ביחס למרחק שהאור עובר בדגימה. קיווטה של 10 mm נותנת בליעה גבוהה פי עשרה מקיווטה של 1 mm המכילה אותה תמיסה. היחס הזה מדויק רק עבור אותה תמיסה, ובגלל האגרגציה ההסתייגות הזאת מהותית.

בפועל, אורך המסלול הוא כלי שמאפשר להישאר בטווח התקף. מסלול ארוך מעניק רגישות לתמיסות מדוללות, שרובן מונומריות. מסלול קצר משאיר דגימה מרוכזת בטווח המדידה ללא דילול נרחב שיקבע מחדש את שיווי המשקל. תוכנית מחקר האגרגציה שממנה נלקחו המספרים לעיל פעלה בדיוק כך: תאים של 1 centimeter עבור צבען בריכוז 1.1 עד 34 micromolar, ותאים של 0.01 centimeter עבור 94 micromolar עד 3.4 millimolar. משטחי מדידה למיקרו־נפחים וקוראי פלטות מוסיפים גאומטריה משלהם, עם מסלולים קצרים ולעיתים משתנים, וכן משטחים שעליהם צבען קטיוני עשוי להיספח. דווחו על אורך המסלול לצד המספר, כפי שמקור הייחוס הספקטרלי מדווח על הממס ועל המלח. בליעה ללא אורך מסלול אינה תוצאה. היא שמועה.

משמעת המדידה נובעת מהמנגנון. הביאו את הדגימות לשיווי משקל בטמפרטורה אחת לפני המדידה. השתמשו באותו סוג קיווטה ובאותה אוריינטציה, בדגימות בלנק תואמות המכילות אותו רקע של מלח ובופר, ובכלי זכוכית נקיים, משום שמתילן כחול נספח לזכוכית ולפלסטיק, וקיווטה מוכתמת נושאת זיכרון של הדגימה המרוכזת האחרונה. מדדו סמוך להכנה כאשר קינטיקת האגרגציה חשובה, ובנו כל עקומת כיול באותה מטריצה ובאותו אורך מסלול כמו הדגימות הלא־ידועות. בבדיקות חזותיות, זכרו שהעין היא ספקטרומטר גרוע. השאלה אם צבע התמיסה יכול להעיד על טוהר היא שאלה נפרדת שהתשובה עליה שלילית, ושינויי גוון עקב אגרגציה הם אחת הסיבות לכך.

תרשים שכדאי להחזיק ליד המכשיר

האיור שלהלן מרכז את המאמר בדף עזר אחד לשולחן המעבדה. שלוש תמיסות מכילות אותו צבען אך נבדלות בריכוז הכולל וברקע המלחים. הספקטרומים הסכמטיים שלהן מראים כיצד חלקו של פס המונומר באורך הגל הארוך פוחת לטובת פס הדימר באורך הגל הקצר ככל שהערימה גוברת. התנאים מודפסים על האיור, משום שבלעדיהם אי אפשר להשתמש בעקומות מחדש. למיקומי פסים שנמדדו בתנאים מוגדרים, השתמשו במקור הייחוס הספקטרלי. למידע על כניסת הצבען לתאים לאחר שהוא נמצא בתמיסה, ראו כניסה לתאים באמצעות חיזור וחלוקה בין פאזות. למידע על האופן שבו מנת האור והגאומטריה משפיעות עוד על תוצאות מדידות פוטוכימיות, ראו חשיפה לאור וגאומטריית מדידה.

לכלל שכדאי לזכור יש שני חלקים. הספקטרום מזהה את התערובת הנמצאת בקיווטה בתנאים המוצהרים. רק כיול שנבנה באותם תנאים ממיר ערך בליעה לריכוז כולל.