האם מתילן כחול יכול לעקוף את קומפלקס III במיטוכונדריה? מדוע המחקרים חלוקים

שתי מעבדות שאלו אם מתילן כחול יכול לעקוף קומפלקס III חסום במיטוכונדריה. אחת השיבה שלא. האחרת השיבה שכן. לשתיהן היו נתונים.

המחקר הראשון, במיטוכונדריות ממוח עכבר, מצא שהצבען אינו יכול לעשות זאת. המחקר השני, במיטוכונדריות מוח משלושה מיני מכרסמים, מצא שהוא יכול לעשות זאת חלקית. מחקר שלישי, בכבד עכבר, מצוטט לעיתים קרובות באותו הקשר, אך בדק דבר אחר. כשממקמים אותו בהקשר הנכון, מחצית מהבלבול נעלמת.

אין כאן מנגנון אוניברסלי שאפשר להכריז עליו. יש שלושה ניסויים עם חוסמים, מינונים ומדדים שונים. תחילה יש לקרוא את תנאי הניסוי. המסקנות נובעות מהם.

מה פירוש עקיפה בהקשר הזה

אלקטרונים נכנסים לשרשרת דרך קומפלקס I ‏(מ-NADH) או קומפלקס II ‏(מסוקצינאט), עוברים דרך קומפלקס III לציטוכרום c, ואז דרך קומפלקס IV לחמצן. המפל שנוצר לאורך הדרך הוא מה שהתא מנצל לייצור ATP.

טענה לעקיפה פירושה שמתילן כחול קולט אלקטרונים לפני החסימה ומוסר אותם אחריה. הצבען המחומצן מקבל אלקטרונים מ-NADH או מרכיבים מוקדמים בשרשרת והופך ללאוקומתילן כחול, והצורה המחוזרת מוסרת אותם לציטוכרום c או בחזרה לשרשרת. אם המסירה מתרחשת אחרי החסימה, הנשימה ופוטנציאל הממברנה מתאוששים חלקית. אם היא מתרחשת בנקודת החסימה או לפניה, אין התאוששות.

פרט אחד בקומפלקס III מכריע חלק ניכר מהמחלוקת הזאת. הקומפלקס מפעיל מחזור Q עם שני אתרי קישור למעכבים. אנטימיצין נקשר לאתר Qi. מיקסותיאזול נקשר לאתר Qo. מחקר המשתמש רק באחד מהם בדק רק מחצית מהקומפלקס.

המחקר הראשון: אין עקיפה במיטוכונדריות ממוח עכבר

גורייב ועמיתיו השתמשו במיטוכונדריות מקליפת המוח של עכברי C57BL/6, שבודדו באמצעות דיגיטונין ונבדקו בריכוז חלבון של 0.1 mg per ml. הסובסטרטים כללו שלושה מערכים: פירובט ומלאט בריכוז 5 mM כל אחד, סוקצינאט בריכוז 10 mM עם גלוטמט בריכוז 2 mM, ו-L-פרולין בריכוז 10 mM. החוסמים היו רוטנון בריכוז 1 micromolar ‏(קומפלקס I) ואנטימיצין בריכוז 1 microgram per ml ‏(קומפלקס III). מינוני הצבען היו 0.5, 1 ו-2 micromolar, והריכוז העיקרי היה 1 micromolar. השיטות ועקומות המדידה מופיעות בדיווח ב-FEBS Letters.

עקיפת קומפלקס I הצליחה. רוטנון הוריד את הנשימה המגורה באמצעות ADP מכ-121 לכ-2 nmol per minute per mg, וצבען בריכוז 1 micromolar החזיר אותה לכ-21. פוטנציאל הממברנה התאושש בנוכחות פירובט ומלאט ובנוכחות L-פרולין.

עקיפת קומפלקס III לא הצליחה. אנטימיצין הוריד את הנשימה לכ-16, והצבען העלה אותה רק לכ-20. פוטנציאל הממברנה לא התאושש עם שום סובסטרט, גם במינוני צבען עד 5 micromolar. נתוני הפראוקסיד הצביעו לאותו כיוון: הצבען לבדו העלה את פליטת הפראוקסיד מקצב בסיסי של כ-76 pmol per minute per mg לכ-1170, 1460 ו-1945 בשלושת המינונים, אך אנטימיצין הפחית את האות הזה, שנוצר בהשפעת הצבען, בכ-25, 88 ו-96 אחוזים בהתאמה. אילו הצבען המחוזר היה מגיב ישירות עם חמצן, חסימת קומפלקס III לא הייתה אמורה לדכא את האות. המחברים הסיקו שהצבען המחוזר מתחמצן באתר Qo של קומפלקס III, לפני חסימת האנטימיצין. במילים, זהו מסלול קצר: מהתורמים לצבען, מהצבען ל-Qo, ומשם הלאה במסלול הרגיל. הרוטנון נעקף. האנטימיצין לא.

המחקר השני: עקיפה חלקית בשלושה מינים, בשני אתרי המעכבים

סוואב ועמיתיו הרחיבו את מערך הניסוי. הם השתמשו במיטוכונדריות מוח מעכברים, חולדות ושרקנים, שבודדו באמצעות Percoll ונבדקו באותו ריכוז של 0.1 mg per ml, בנוכחות פירובט ומלאט או גלוטמט ומלאט בריכוז 5 mM כל אחד. הם השתמשו בשני חוסמים של קומפלקס III: אנטימיצין A בריכוז 0.3 micromolar ומיקסותיאזול בריכוז 1 micromolar. ריכוז הצבען היה 2 micromolar ברוב הבדיקות, ו-0.5 בעבודה עם ציטוכרום c. כל שלושת המינים, שנבדקו בפרוטוקולים תואמים, מופיעים במאמר בגישה פתוחה.

שתי החסימות נעקפו חלקית בכל שלושת המינים. במיטוכונדריות של עכבר, אנטימיצין דיכא את הנשימה והצבען העלה אותה בכ-60 אחוזים, מכ-37 ל-59 nmol per minute per mg. מיקסותיאזול דיכא אותה ב-88 אחוזים, לכ-4.5, והצבען העלה אותה פי חמישה לכ-23. פוטנציאל הממברנה עבר קיטוב מחדש באופן חלקי בנוכחות כל אחד מהמעכבים. הוא נמדד באמצעות שני צבעים, ספרנין O ו-TMRM רציומטרי, כדי לשלול ארטיפקטים אופטיים.

המאמר הזה גם בדק ישירות את מסירת האלקטרונים, דבר שהמחקר הראשון לא עשה כלל. ציטוכרום c חיצוני שעבר אצטילציה, בריכוז 25 micromolar, לא חוּזר על ידי מיטוכונדריות במצב אנרגטי פעיל, עם מעכבים או בלעדיהם, אך הוספת הצבען הובילה לחיזור בשני המקרים. בתמיסת בופר ללא תאים, NADH יחד עם הצבען חיזרו ציטוכרום c בקצב יחסי לריכוז NADH. במילים, זהו דילוג ארוך יותר: שקולי חיזור לצבען, מהצבען ישירות לציטוכרום c, ומקומפלקס IV לחמצן. המסלול הזה מדלג לחלוטין על קומפלקס III, ולכן ניתן לעקוף את שני החוסמים.

שני מדדים נוספים תומכים בפרשנות הזאת. פלואורסצנציית NAD(P)H ירדה כשהצבען נוסף למיטוכונדריות שטופלו במיקסותיאזול, כלומר שקולי חיזור התנקזו דרך המסלול החדש. בנוסף, בליעת האור של הצבען ב-660 nm עקבה אחר כל הוספה בתורה, ואילו נוזלי העל שהתקבלו לאחר צנטריפוגה הראו שהצבען המחומצן הצטבר בתוך מיטוכונדריות במצב אנרגטי פעיל בריכוז גבוה פי יותר ממאה, ואז יצא כשהפוטנציאל קרס. גם מאזן הפרוטונים מתאים: דילוג על שלבי השאיבה משאיר כ-2 פרוטונים לכל זוג אלקטרונים במקום 10, ולכן צריכת חמצן מהירה יותר לצד קיטוב מחדש חלקי בלבד היא התמונה הצפויה מעקיפה אמיתית, ולא ראיה נגדה.

אותה הכנה הניבה תגובות שמכשילות קריאה שטחית. בנוכחות מעכב וצבען, ADP הוריד את הנשימה במקום להעלות אותה, וחסימת ההובלה הגבירה אותה במקום להאט אותה, בעוד שפוטנציאל הממברנה עדיין השתנה בכיוונים הרגילים. צריכת חמצן לבדה מטעה במערכת הזאת.

המחקר השלישי: מחקר הכבד שבדק את קומפלקסים I ו-II, לא את III

לי ובואלסטרלי השתמשו במיטוכונדריות מכבד עכבר ובהפטוציטים בתרבית שנפגעו מאפאבירנז (קומפלקס I, ‏IC50 קרוב ל-30 micromolar) ומהידרזין, המטבוליט של איזוניאזיד (קומפלקס II, ‏IC50 קרוב ל-30 micromolar). צבען בריכוז של כ-30 micromolar שיקם את חמצון NADH, את פוטנציאל הממברנה ואת ATP, ובמקביל הפחית מחמצנים ומוות נמקי. המאמר ב-Redox Biology מציג מודל שבו הצבען נושא אלקטרונים במסלול העוקף את קומפלקסים I ו-II הפגועים.

התוצאה הזאת מספקת הקשר מבוסס לגבי השלבים המוקדמים בשרשרת, ואינה אומרת דבר על קומפלקס III, משום ששום רכיב בו לא נחסם. היא אינה יכולה לאשש או להפריך אף אחד משני מחקרי המוח.

מטריצת התנאים

ארבע סיבות לכך ששני מחקרי קומפלקס III יכולים להיות נכונים בתנאי הניסוי שלהם

1. החוסם לא היה אותה התערבות. אנטימיצין לבדו בריכוז 1 microgram per ml לעומת אנטימיצין בריכוז 0.3 micromolar וחוסם נפרד של אתר Qo. מסלול שבו הצבען מזרים אלקטרונים לאתר Qo נכשל בדיוק במקום שבו מסלול ישיר לציטוכרום c מצליח. אתר אחד אינו יכול לייצג את שניהם.

2. מינון הצבען והתזמון היו שונים. ריכוזים עיקריים של 1 לעומת 2 micromolar, בחומר המשתתף במחזורי חמצון־חיזור, שקליטתו וחיזור ציטוכרום c ישירות באמצעותו תלויים בריכוז ובזמן. הבדלים קטנים במינון, יחד עם תזמון שונה של המדידות, יכולים לחשוף מסלולים שונים באותה רשת.

3. ההכנות היו שונות. בידוד באמצעות דיגיטונין לעומת בידוד במפל Percoll בוחר אוכלוסיות מיטוכונדריה חופפות, אך לא זהות. ריכוז החלבון היה תואם, 0.1 mg per ml, ולכן אפשר להוציא את המשתנה הזה מהמשוואה, אך לא את תת־האוכלוסייה ואת שלמות המיטוכונדריות. גם ההבדל בין המינים נשלל כהסבר: הקבוצה השנייה שחזרה את התופעה גם בעכבר.

4. מצב הסובסטרטים קובע מה הצבען יכול לעשות. שלושה מערכי סובסטרטים לעומת צמדים הקשורים ל-NADH. אספקת NADH ופוטנציאל הממברנה קובעים יחד כמה מהר הצבען עובר חיזור וכיצד הוא מתחלק בין המדורים, ומסלול הזקוק לצבען מחוזר לצד ציטוכרום c מחומצן תלוי בבחירה הזאת.

איך לקרוא את הטענה הבאה לעקיפה

שאלו איזה קומפלקס נחסם, באמצעות איזה מעכב, באיזה אתר ובאיזה מינון. שאלו מה היה ריכוז הצבען ומתי בוצעה המדידה. שאלו מה היו הרקמה, המין, שיטת הבידוד, ריכוז החלבון והסובסטרט. ושאלו אם הפוטנציאל, הנשימה, מצב החמצון־חיזור ובדיקה ישירה של מסירת האלקטרונים מצביעים לאותו כיוון, משום שצריכת חמצן לבדה הובילה כאן למסקנה שגויה יותר מפעם אחת.

הסיכום המצומצם נותר תקף. עקיפת קומפלקס I באמצעות הצבען מוסכמת. לגבי קומפלקס III, מיטוכונדריות של עכבר בנוכחות אנטימיצין בריכוז 1 microgram per ml וצבען בריכוז 1 micromolar אינן מראות עקיפה תפקודית, ואילו שלושה מינים בנוכחות אנטימיצין בריכוז 0.3 micromolar או מיקסותיאזול בריכוז 1 micromolar וצבען בריכוז 2 micromolar מראים עקיפה חלקית, עם העברה ישירה מהצבען לציטוכרום c. שני המשפטים האלה יכולים להתקיים זה לצד זה. כל אמירה רחבה יותר היא אקסטרפולציה.

הקריאה הנלווית ממקמת את הטענה השנויה במחלוקת בתוך הכימיה שאינה שנויה במחלוקת: כיצד מתילן כחול מעביר אלקטרונים להבנת שרשרת המסירה, ניסויי עקיפת קומפלקס I למקרה המבוסס בשלבים המוקדמים בשרשרת, מדידות פוטנציאל הממברנה והארטיפקטים שלהן להבנת הצורך בשני צבעים, וכן עבודה מעבדתית עם חומרים המשתתפים במחזורי חמצון־חיזור להבנת המלכודות הקשורות למינון ולתזמון.