חלופות למתילן כחול במיקרוסקופיה: בחירה לפי המשימה

למשטח חיידקים פשוט, קריסטל ויולט יכול להחליף מתילן כחול כאשר המטרה היא לראות את צורת התאים. עבור תאים חיים, חלופה טובה יותר עשויה להיות ניגוד מופע ללא צביעה כלל. הבחירה תלויה בתצפית שעליכם לבצע.

נניח ששני אנשים בוחנים את אותה תרבית חיידקים. אחד רוצה להבחין בין תאים דמויי מתג לבין תאים עגולים. האחר רוצה לדעת אם טיפול הרג את החיידקים. צביעה שמספקת לאדם הראשון תמונה ברורה עשויה שלא לספק לאדם השני תשובה שימושית.

לפני בחירת תחליף, השלימו את המשפט הבא: „אני צריך לצפות ב-___ בתוך ___, והתאים חייבים / אינם חייבים להישאר בחיים.” המשפט הזה מגדיר את התפקיד שהצביעה צריכה למלא.

התחילו מהדגימה ומהשאלה

תחילה החליטו אם התאים חייבים להישאר בחיים, ולאחר מכן הגדירו את התכונה שעליכם לצפות בה:

• התאים חייבים להישאר בחיים: לתנועה או לצורה, שקלו ניגוד מופע ללא צביעה או DIC; ל-DNA גרעיני, שקלו Hoechst 33342 עם פלואורסצנציה; לשלמות הממברנה, בחרו בבדיקה שעברה תיקוף, כגון SYTO 9 עם propidium iodide.
• התאים אינם חייבים להישאר בחיים: למורפולוגיה חיידקית, שקלו צביעה פשוטה בקריסטל ויולט או צביעה שלילית בניגרוזין; לתגובת גראם, השתמשו בשיטת צביעת גראם המלאה; ל-DNA גרעיני בתאים מקובעים, שקלו פלואורסצנציה עם DAPI.

השתמשו בטבלה זו כדי להשוות בין המגבלות של כל מסלול. אלה הן בחירות בין שיטות, ולא הוראות להחלפת בקבוקים בתוך פרוטוקול קיים.

למשטח פשוט, החליפו את השיטה בזהירות

קריסטל ויולט הוא אפשרות מעשית כאשר המשימה היא לקבל תצוגה חד-צבעית של מורפולוגיית החיידקים. המדריך Bacteriological Analytical Manual של ה-FDA מפרט שתי פורמולציות של קריסטל ויולט המתאימות לצביעה פשוטה. השתמשו בפורמולציה מתועדת ובשיטת ההכנה שלה; שם הצבע לבדו אינו מגדיר ריאגנט מוכן לשימוש.

קריסטל ויולט משמש גם בצביעת גראם, אך עובדה זו אינה הופכת צביעה פשוטה בקריסטל ויולט לצביעת גראם. לפי פרוטוקול צביעת גראם של ASM, התוצאה המבדילה תלויה בפעולה רציפה של קריסטל ויולט, יוד, דה-קולוריזציה וצביעת ניגוד. השמטת שלבים אלה משנה את מה שניתן להסיק מן התמונה. ראו צביעה פשוטה לעומת צביעת גראם להסבר על ההבדל.

ניגרוזין מציע דרך אחרת לחשוף את קווי המתאר: הוא מכהה את הרקע בעוד שתאי החיידקים נשארים בהירים יחסית. בהוראות של Merck לניגרוזין יש פרט שימושי שרשימה כללית של תחליפים עלולה להחמיץ. הפורמולציה המוגדרת לשימוש מכילה פורמלדהיד. לכן אי אפשר להסיק התאמה לתאים חיים מן המילים „צביעה שלילית”, אף שהתאים עצמם נראים לא צבועים. בדקו את הפורמולציה המלאה ואת אופן הכנת הדגימה.

עבור דגימות חיות, שקלו לשנות את האופטיקה

אם אתם רוצים לצפות בתאים נעים או מתחלקים, הוספת צבע נוסף עלולה לסבך את התצפית. כפי ש-Nikon מסבירה במדריך שלה בנושא ניגוד בדגימות שקופות, ניגוד מופע וניגוד התאבכות דיפרנציאלי, או DIC, הופכים דגימות לנראות באמצעות הבדלים בתכונות האופטיות שלהן. הם יכולים לחשוף תאים חיים ולא צבועים, בתנאי שהמיקרוסקופ כולל את הרכיבים הנדרשים.

בחירה זו משמרת הכנה ללא צביעה, אך משנה את סוג המידע הזמין. אפשר לעקוב אחר גבול או תנועה מבלי לדעת איזו מולקולה יצרה את הניגוד. אם השאלה היא לוקליזציה מולקולרית, בחרו במקום זאת בשיטת סימון מתאימה.

עבור DNA גרעיני, ההשוואה של Invitrogen בין צביעות DAPI ו-Hoechst מבחינה בין השימוש הנפוץ ב-DAPI בתאים מקובעים לבין Hoechst 33342, החדיר יותר לתאים ומועדף לסימון תאים חיים. שתי השיטות דורשות ציוד פלואורסצנציה. אף אחת מהן אינה תחליף ישיר לצביעה צבעונית בשדה בהיר.

התייחסו לחשיפה לצבע ולתאורה כתנאים ניסויים. השוו בין הכנות צבועות ולא צבועות כאשר התנהגות התאים היא המדד שלכם.

תא אדום אינו בהכרח תא מת

SYTO 9 ו-propidium iodide משמשים לעיתים קרובות יחד כדי להעריך את שלמות ממברנת החיידקים. המדריך של BacLight מקשר ממברנות שלמות לצביעה ירוקה וממברנות פגועות לצביעה אדומה. פרשנות זו דורשת תיקוף עבור הדגימה המסוימת.

מחקר משנת 2019 של Rosenberg ועמיתיו ממחיש את הבעיה. בביופילמים בני 24 שעות של E. coli על זכוכית בתמיסת מלח מבוססת פוספט, כ-96% מהתאים נראו חיוביים ל-propidium iodide במקומם. עם זאת, החוקרים העריכו כי 82% היו ניתנים לתרבית לאחר האיסוף. תמונות קונפוקליות הראו תאים עם פנים ירוק מתחת לחומר שנצבע באדום, דבר שהצביע על חומצות גרעין חוץ-תאיות כמקור לאות המטעה.

האחוזים האלה מתארים מדידות שונות שבוצעו בהכנות של המחקר, ולא מקדם תיקון אוניברסלי. הלקח השימושי הוא לבדוק מה יצר את האות. בביופילם, צבע לחומצות גרעין יכול לזהות חומר מחוץ לתאים וגם בתוך תאים פגועים. לצורך מסקנה לגבי חיוניות, החוקרים ממליצים על מדידות משלימות, כגון גידול בתרבית או פעילות מטבולית, תוך הכרה בכך שגם לכל אחת מהן יש מגבלות.

בדקו מה החלופה באמת מכילה

שיטת צביעה חלופית עדיין עשויה להכיל מתילן כחול. Giemsa היא דוגמה לכך: Merck מתארת את המוצר שלה כתמיסת azure-eosin-methylene-blue, המיועדת בין היתר למשטחי דם ומח עצם. זו יכולה להיות שיטה שונה עבור דגימה שונה, אך היא אינה עומדת בדרישה להימנע ממתילן כחול.

אם החרגת תרכובת היא חלק מהניסוי, בדקו את זהות הריאגנט ואת הפורמולציה לפני השוואת התמונות. המדריך בנושא methyl blue, methylene blue וצבעים בעלי שמות דומים עוסק בהבדלים בין השמות.

אמתו את ההחלפה לפני השימוש בתוצאה

עבור שיטה חדשה, בצעו השוואה קטנה באמצעות דגימות מייצגות ובקרה מתאימה. שמרו ככל האפשר על הגדרות מיקרוסקופ דומות. תעדו את פורמולציית הריאגנט, הכנת הדגימה, החשיפה ותנאי ההדמיה, כדי שניתן יהיה לבדוק מדוע תמונה נראית טובה יותר במקום פשוט להעדיף אותה.

העריכו הצלחה ביחס לשאלה המקורית. עבור מורפולוגיה, בדקו אם גבולות התאים וסידורם עדיין ניתנים לפענוח. עבור סימון גרעיני, בדקו את מיקום האות ואת הרקע. עבור חיוניות, דרשו ראיות מעבר להפרדת צבעים אטרקטיבית. המדריך הרחב יותר בנושא צביעה במתילן כחול ויישומים מעבדתיים מסביר כיצד התצפית וההכנה משתלבות זו בזו.

בחרו בחלופה שמשמרת את המדידה הדרושה לכם. צבע הוא רק תכונה אחת של התמונה המתקבלת.