Solubilidade do azul de metileno e preparación de solucións: unha guía de laboratorio

Dous técnicos preparan, cada un, unha solución de azul de metileno ao 1 por cento a partir do po. Un pesa 1.00 gramo e enrasa o matraz a 100 mL. O outro pesa 1.00 gramo, engádeo a 100 mL de auga e dá a preparación por rematada. Un terceiro técnico pesa 1.00 gramo dun lote diferente e obtén unha concentración cunha diferenza medible. Os tres frascos levan a mesma etiqueta. Ningún contén exactamente o que indica a etiqueta, e as diferenzas proceden de tres conceptos que se confunden con facilidade: canto soluto pode admitir o disolvente, que é realmente o po pesado e a que se refire a porcentaxe.

Esta guía trata unicamente da formulación no laboratorio: colorantes para tinción, indicadores, solucións nai analíticas e dilucións de traballo. Non é unha receita para medicamentos orais ou inxectables, e as concentracións aquí indicadas non deben interpretarse como doses.

Que determina a solubilidade e que non

A solubilidade do azul de metileno en auga é alta para un colorante. A ficha do composto azul de metileno en PubChem indica uns 43.6 gramos por litro a 25 C, o que equivale a 4.36 gramos por 100 mL, ou ao 4.36 por cento w/v. Un estudo independente de equilibración á mesma temperatura mediu 43.21 g/L e confirmou o valor anterior dentro da marxe de erro experimental.

Ese número é un límite máximo, non un obxectivo. Unha solución nai ao 1 por cento contén 10 g/L, menos da cuarta parte do límite máximo. Unha solución nai ao 0.1 por cento contén 1 g/L, aproximadamente a súa cuadraxésima parte. Se unha preparación ao 1 por cento deixa sólidos persistentes tras unha mestura adecuada a temperatura ambiente, o problema case nunca é o límite de solubilidade. Adoita deberse a unha humectación incompleta, auga fría, grumos de po que precisan máis tempo ou un soluto mal identificado. A auga morna e a axitación resolven a maioría destes problemas. Se se aplicou calor, deixe que o matraz volva á súa temperatura de calibración antes de axustalo ao volume final.

A solubilidade noutros disolventes é menor e presenta máis variación entre fontes, en parte porque difire o estado de hidratación do material ensaiado. A auga segue a ser o disolvente de referencia para as solucións nai de uso habitual no laboratorio. O etanol disolve o colorante, pero admite unha cantidade considerablemente menor que a auga; o cloroformo tamén o disolve, a piridina só lixeiramente e o éter dietílico practicamente non o disolve. Nas series de medicións, a acetona e o acetato de etilo presentan valores moi inferiores aos da auga. Para traballos en medios non acuosos, considere calquera valor dun manual como unha estimación inicial e verifíqueo co lote real, en lugar de tomalo como un límite de formulación. A conclusión práctica é sinxela: se o obxectivo é unha concentración acuosa definida igual ou inferior ao 1 por cento, a auga ofrece unha ampla marxe.

O po non é sempre o mesmo

O po de azul de metileno vendido para uso de laboratorio é un sal de cloruro que contén auga na súa rede cristalina, e a cantidade desa auga varía. O ión anhidro ten unha masa molecular de 319.85 g/mol. O trihidrato citado habitualmente ten unha masa molecular de 373.90 g/mol e o pentahidrato de 409.93 g/mol, valores recollidos nos datos da monografía USP resumidos xunto á ficha de PubChem.

Os frascos comerciais adoitan estar etiquetados como trihidrato, CAS 7220-79-3, pero os estudos do estado sólido atoparon que o material real pode ser un pentahidrato, un hidrato parcial con preto de 2.2 moléculas de auga, un dihidrato ou un monohidrato, sen unha fase cristalina diferenciada de trihidrato nalgunhas análises. O colorante tamén é higroscópico, polo que o contido de auga dun frasco aberto cambia co tempo. Para a tinción cualitativa isto apenas importa. Para o traballo analítico cuantitativo importa moito; por iso, a guía para interpretar a valoración e o contido de auga nun certificado de análise dá prioridade ao documento do lote fronte á palabra trihidrato da etiqueta frontal.

Disto derívanse dúas vías de corrección, e só debe empregarse unha de cada vez. Se o certificado indica a valoración e o contido de auga ou a perda por desecamento, empregue eses valores directamente. Se non existen datos do certificado e a concentración debe expresarse sobre unha base de equivalente anhidro, aplique o factor teórico do hidrato: 373.90 dividido por 319.85, ou 1.169, para o trihidrato nominal, e 409.93 dividido por 319.85, ou 1.282, para o pentahidrato nominal. Non aplique as dúas correccións á vez. Iso contabiliza a auga dúas veces.

Que significa a porcentaxe

A porcentaxe w/v significa gramos do soluto especificado por 100 mL de solución final, non por 100 mL de auga inicial. Así, o 1 por cento w/v corresponde a 1.000 g por 100 mL finais, equivalente a 10 mg/mL ou 10 g/L. Unha solución ao 0.1 por cento contén 0.100 g por 100 mL finais, equivalente a 1 mg/mL. A confusión habitual entre o 1 por cento e 1 mg/mL supón un erro dun factor de dez, e paga a pena revisar todas as etiquetas para detectalo.

A segunda parte da definición é a especificación do soluto. Unha solución ao 1 por cento de po de trihidrato tal como se pesou e unha solución ao 1 por cento expresada como equivalente anhidro son solucións diferentes. Os exemplos resoltos a continuación indican sempre tanto o volume final como a base de expresión, un hábito que evita o problema dos tres técnicos descrito ao comezo.

Preparacións resoltas, coas hipóteses de hidratación indicadas

Todos os exemplos supoñen po puro do hidrato indicado e auga como disolvente a temperatura ambiente. Para outros volumes, axuste as cantidades de maneira proporcional.

Exemplo A: 100.0 mL ao 1 por cento w/v, sobre a base do trihidrato tal como se pesou. Pese 1.000 g de trihidrato de azul de metileno. Engada uns 70 mL de auga purificada, axite ou mova circularmente ata a disolución completa, transfira cuantitativamente a un matraz aforado de 100.0 mL con enxaugaduras e, despois, engada auga ata a marca de aforo. O soluto é o propio trihidrato, polo que non se aplica ningunha corrección de masa molecular. Resultado: 1.000 g por 100.0 mL finais, ou 10 mg/mL de po tal como se pesou.

Exemplo B: 100.0 mL a 1 mg/mL, sobre a base de equivalente anhidro, a partir de trihidrato nominal. O obxectivo é obter 100.0 mg de azul de metileno anhidro en 100.0 mL finais. Multiplique por 1.169 para corrixir polas tres moléculas de auga: 100.0 mg por 1.169 é igual a 116.9 mg. Pese 116.9 mg de trihidrato nominal, disólvao nuns 70 mL de auga e axuste a 100.0 mL finais nun matraz aforado. A partir de pentahidrato nominal, o factor é 1.282, polo que o mesmo obxectivo require 128.2 mg. Anote na etiqueta que factor se empregou.

Exemplo C: dilución de azul de metileno dunha solución nai ao 1 por cento ata o 0.1 por cento. Empregue C1V1 igual a C2V2. Para preparar 100.0 mL ao 0.1 por cento a partir dunha solución nai ao 1.0 por cento, o volume necesario de solución nai é 0.1 por 100.0 dividido por 1.0, que dá 10.0 mL. Pipetee 10.0 mL da solución nai ao 1 por cento nun matraz de 100.0 mL e engada auga ata a marca de aforo. Para os analistas que prefiran unidades de masa: o 1 por cento equivale a 10 mg/mL, polo que 10.0 mL conteñen 100 mg, e 100 mg en 100.0 mL finais equivalen a 1 mg/mL, que é o 0.1 por cento.

Exemplo D: 1.000 L de solución de traballo a 10 mg/L a partir dunha solución nai a 1 mg/mL. Unha solución nai a 1 mg/mL equivale a 1000 mg/L. O volume necesario é 10 por 1.000 dividido por 1000, que dá 0.0100 L, ou 10.0 mL. Pipetee 10.0 mL da solución nai e dilúa con auga ata 1.000 L finais. A partir dunha solución nai ao 1 por cento, a 10,000 mg/L, o mesmo obxectivo require só 1.00 mL, axustado a 1.000 L. A dilución seriada en dous pasos proporciona maior exactitude que unha única transferencia de microlitros cando a relación supera aproximadamente un cento.

Cada unha destas preparacións é unha especificación completa só porque contén tres datos: a masa pesada coa súa hipótese de hidratación, o volume final da solución e a base da concentración indicada. Unha anotación no caderno á que lle falte calquera dos tres non se pode reproducir exactamente.

Procedemento para evitar os erros habituais

Disolva primeiro o po nun volume inferior ao final e, despois, axuste o volume. Engadir o po directamente ao volume final completo de auga produce unha solución cuxo volume total supera a marca prevista, polo que a concentración resulta inferior á desexada. Enxaugue o vaso de precipitados e transfira as enxaugaduras ao matraz para que non quede colorante atrás; a cor intensa fai visibles as pequenas perdas, o que é unha vantaxe se favorece a transferencia cuantitativa.

Mesture ata que non queden partículas antes de axustar o volume e inspeccione a contraluz. Filtre só cando o método o requira. O azul de metileno adsórbese a algúns materiais de membrana, polo que a filtración pode reducir a concentración dunha solución nai que acaba de estandarizarse. Este fenómeno está documentado en estudos de adsorción en membranas e convén lembralo sempre que a filtración ou a verificación da concentración formen parte do método. Se unha solución nai filtrada debe ter unha concentración certificada, verifique a concentración despois da filtración, non antes.

Garde as solucións preparadas protexidas da luz intensa en frascos de cor ámbar ou opacos a temperatura ambiente, e etiquete co soluto, a base de hidratación, a concentración, o disolvente, a data e a persoa que as preparou. A fotodecoloración baixo iluminación sostida é unha vía de degradación coñecida, polo que os peitorís das ventás e os frigoríficos iluminados son lugares de almacenamento pouco adecuados, aínda que o colorante pareza estable. As expectativas de estabilidade e os intervalos de reanálise trátanse na guía de almacenamento e estabilidade das solucións preparadas, pero, como norma de traballo, as solucións nai analíticas deben prepararse de novo ou volver verificarse, en lugar de confiar nelas indefinidamente.

Manipule o po e as solucións nai concentradas con luvas, protección ocular, bata de laboratorio e unha cuberta protectora para a bancada, e empregue contención secundaria para os frascos. O colorante mancha rapidamente a pel, a roupa, as bancadas e os plásticos, e as fichas de datos de seguridade dos provedores clasifican o po como nocivo en caso de inxestión e irritante para os ollos e a pel, segundo o grao. As precaucións completas trátanse nas prácticas de manipulación e almacenamento seguros, pero o control das manchas é en si mesmo unha medida de calidade: o colorante residual no material de vidro e nas pipetas é unha fonte de contaminación cruzada para as análises de trazas.

Unha nota sobre o grao

Para baños de tinción e demostracións, calquera grao de laboratorio limpo preparado á concentración correcta cumpre a súa función. Para traballos cuantitativos ou comparativos, o grao importa porque as impurezas difiren: Azure B residual e tiazinas relacionadas, metais pesados, disolventes residuais e carga microbiana. Por iso, elixir un grao avalado por un certificado de análise completo forma parte da formulación e non é algo que se deba deixar para despois. Un documento completo do lote indica a identidade, a valoración coa súa base de expresión, o contido de auga e o conxunto de impurezas realmente analizadas, de modo que a corrección por hidratación dos exemplos anteriores emprega valores medidos en lugar da hipótese de trihidrato nominal. Cando dous lotes dan concentracións diferentes a partir da mesma masa pesada, o certificado adoita explicar o motivo.