Paul Ehrlich e o azul de metileno: como un colorante axudou a dar forma ao descubrimento de fármacos

A contribución de Paul Ehrlich á medicina non foi un fármaco. Foi un argumento sobre como estudalo.

En 1878 presentou unha tese de doutoramento cuxa sección inicial se titulaba "A concepción química da tinción". O seu argumento era que tinguir un corte de tecido e tinguir un anaco de tea seguen a mesma lóxica. En ambos os casos, a cor fíxase por unha afinidade química entre o colorante e o material, non porque o tecido sexa absorbente, graxo ou teña unha forma que atrape un pigmento. Ehrlich medrara vendo o seu curmán, o patólogo Karl Weigert, preparar cortes tinguidos, e o que lle chamaba a atención non eran as imaxes, senón o feito de que o colorante escollese onde ir.

A afirmación parece modesta. Non o é. Se un colorante se une a un tecido por razóns químicas, o patrón de tinción informa sobre a química dese tecido. Un portaobxectos tinguido deixa de ser unha ilustración e convértese nunha medición.

Inmediatamente desenvolveu esa idea. En 1880 combinou azul de metileno con fucsina ácida e chamou á mestura colorante neutro, un neutralen Farbkörper, que distinguía os diferentes tipos de glóbulos brancos onde os colorantes individuais daquela en uso non o conseguían. Dous anos despois presentou un método con violeta de metilo para tinguir bacilos da tuberculose, e Koch adoptou o procedemento no seu propio traballo.

A teoría que máis tarde lles deu a estas prácticas un fundamento común é unha cuestión á parte, e adoita simplificarse a súa cronoloxía. A teoría das cadeas laterais de Ehrlich, a idea de que unha substancia actúa sobre unha célula porque ambas son quimicamente compatibles, pertence á década de 1890, non aos anos dos colorantes. O que achegou o traballo anterior foi a convicción previa: a selectividade é química e, polo tanto, pode buscarse en vez de atoparse por casualidade.

O experimento que converteu o colorante nun mapa

En 1885 Ehrlich publicou unha monografía sobre as necesidades de osíxeno do organismo, subtitulada como un estudo analítico da cor. O seu método consistía en inxectar colorantes cuxa cor depende do estado de oxidación e despois comparar como os distintos órganos os reducían ou conservaban. O colorante empregábase como un instrumento, do mesmo xeito que se emprega un termómetro: informaba sobre condicións no interior do tecido que non podían examinarse directamente. Segundo o propio Ehrlich, o obxectivo era determinar, coa axuda de certos colorantes, o poder redutor dos órganos vivos.

O resultado co azul de metileno chegou en 1886, nun artigo sobre a reacción do colorante coa substancia nerviosa viva, lido ante unha sociedade médica no mes de decembro anterior. Introduciuse azul de metileno na circulación dun animal vivo e despois extraéronse cortes finos de tecido que se expuxeron ao aire, de modo que o colorante incoloro acumulado se oxidase de novo á súa forma azul e mostrase onde se concentrara. As células nerviosas e as fibras nerviosas adquiriron a cor, e fixérono cunha selectividade suficiente para que a técnica se convertese nun método habitual para visualizar o tecido nervioso. O composto xa non era só unha materia colorante aplicada a un corte morto nunha mesa de laboratorio. Era un marcador que se distribuía dentro dun corpo vivo, e esa distribución podía interpretarse.

A propiedade que sustenta ambos os experimentos merece expresarse con claridade, porque todo o demais nesta historia depende dela. O azul de metileno é reversible. A súa forma reducida, o leucoazul de metileno, é incolora e, ao entrar en contacto co osíxeno, volve ao catión azul. Unha solución do colorante con glicosa nun frasco pechado é incolora; ao abrir o frasco, vólvese azul. Segundo se recolle, Ehrlich demostrouno directamente tratando cortes tinguidos con cloruro de ferro, ademais de expoñelos ao aire, e observando como reaparecía a cor. Un colorante que cambia de cor co estado redox do seu contorno é unha sonda para ese contorno.

Así, dúas propiedades coexistían. Un colorante podía distinguir un tecido doutro. E un colorante podía activarse e desactivarse mediante un cambio no estado de oxidación.

Vista retrospectivamente, a segunda propiedade é o comezo da quimioterapia. Se un composto se une a un tipo de tecido e non a outro, ese mesmo composto podería chegar a un tipo de organismo e non a outro. Ehrlich formulou a inferencia directamente: se un patóxeno podía tinguirse de maneira selectiva, a tinción podería indicar un dano específico a ese patóxeno. Polo tanto, un colorante podería empregarse como fármaco, dirixido contra un invasor e non contra o paciente.

A primeira proba nun paciente non foi para a malaria. En 1890, xunto co psiquiatra Arthur Leppmann, Ehrlich informou de que o azul de metileno aliviaba a dor en afeccións neurálxicas e reumáticas de músculos, articulacións e tendóns. Os dous debateron se o fármaco podería actuar sobre as enfermidades mentais e decidiron non probalo. Un médico italiano, Pietro Bodoni, de Xénova, fíxoo de todos os xeitos. O título do seu artigo de 1899 alude a unha acción sedante en diversas formas de psicose: describiu un efecto calmante en catorce pacientes axitados e sinalou que outros médicos de Xénova xa estaban empregando o colorante co mesmo fin. A sedación non é un efecto sobre a enfermidade, e esta distinción reaparece ao longo desta historia.

O traballo sobre a malaria chegou en 1891, co patólogo Paul Guttmann, no hospital de Moabit, en Berlín. Administrouse azul de metileno a dous pacientes, e o informe apareceu no Berliner klinische Wochenschrift do 28 de setembro de 1891. No primeiro caso, o paciente tomou 0.5 g do colorante dunha soa vez na noite do 29 de xuño; o ataque que se esperaba non chegou a manifestarse por completo, e a única molestia rexistrada despois foi unha estranguria leve con urina azul. Os ataques de febre desapareceron durante os primeiros días, e os parasitos desapareceran do sangue como moi tarde ao oitavo día. O resumo dos propios autores foi que as súas expectativas se cumpriran por completo. Dous casos sen control non constitúen unha demostración. A exposición máis completa sobre o azul de metileno e a malaria, incluídos os ensaios modernos, corresponde a unha páxina propia, e a pregunta interesante aquí é máis concreta: canto do razoamento de Ehrlich resistiu o contacto co parasito.

Onde se sostivo o razoamento e onde fallou

Non sobreviviu gran cousa do mecanismo, polo menos non na forma que propuxo Ehrlich. A versión ordenada, na que un catión tricíclico plano se introduce entre os pares de bases do ADN do parasito, non se sostén no caso de Plasmodium. Un glóbulo vermello infectado reduce o azul de metileno con tanta facilidade que este nunca chega ao parasito como catión plano, e a explicación da intercalación que encaixa cos colorantes de acridina non encaixa con este.

O que si apoian as probas é menos ordenado. O azul de metileno inhibe a glutatión redutase do parasito a concentracións que un paciente pode alcanzar. Bloquea a conversión do hemo en hemozoína, o pigmento inerte que o parasito produce para evitar intoxicarse coa súa propia dixestión da hemoglobina, aproximadamente coa mesma eficacia ca a cloroquina e con moita máis eficacia ca a quinina. O seu ciclo redox tamén xera especies reactivas de osíxeno nunha célula que xa as está producindo. Aínda non se determinou cal destes é o mecanismo real, ou se todos contribúen.

Hai unha complicación adicional, e debería condicionar a lectura de calquera afirmación histórica sobre este composto. O azul de metileno comercial daquela época non era unha única substancia. As mostras contiñan azure B, o conxénere monodesmetilado, e as solucións máis antigas acumulaban unha maior cantidade del. Azure B é un colorante metacromático con dianas diferentes: tingue de azul intenso o ADN de dobre cadea e de verde o ARN. Unha mestura de dous colorantes con destinos diferentes, en proporcións que ninguén rexistrou, non permite unha afirmación inequívoca sobre o que fixo o azul de metileno que contiña.

O colorante en si nunca desprazou a quinina. O método tivo máis éxito. Wilhelm Roehl, discípulo de Ehrlich que traballaba para o conglomerado de colorantes e fármacos IG Farben, seguiu promovendo derivados de colorantes como medicamentos para enfermidades tropicais e achegou a ferramenta que faltaba: o canario, infectado cunha malaria aviaria, como sistema habitual de cribado de compostos candidatos. Werner Schulemann modificou despois a cadea lateral, e o sal de fenotiazinio resultante curou a infección experimental. Aínda volvía azuis os pacientes.

O resultado duradeiro non foi nin o colorante nin o sistema de aneis, senón a cadea lateral. Engadir un grupo dialquilaminoalquilamino cambiou o comportamento da molécula, e ese fragmento sobreviviu a todos os redeseños posteriores. Se se conserva ese grupo e se substitúe o anel de fenotiazinio por unha acridina, o resultado é a quinacrina. Se se introduce unha quinolina, o resultado é a cloroquina. A pamaquina, a primaquina e a amodiaquina, todas aínda no catálogo de antipalúdicos, levan o mesmo grupo. O composto que fracasou como tratamento achegou a peza que tivo éxito.

A conexión cos antipsicóticos pasa polo anel, non polo fármaco. Foi a elucidación da estrutura do azul de metileno a que levou a Heinrich August Bernthsen ao núcleo básico da fenotiazina en 1883, e esa estrutura, substituída de diferentes maneiras, era a que estudaban os químicos de Rhône-Poulenc na década de 1940 mentres buscaban antihistamínicos. Un deses compostos sintetizouse contra finais de 1950 e foi probado polo cirurxián Henri Laborit, quen observou que deixaba os pacientes tranquilos e indiferentes. O seu primeiro uso psiquiátrico publicado, nun paciente con manía, chegou en xaneiro de 1952. O primeiro antipsicótico non é tanto un descendente do antipalúdico de Ehrlich como un parente afastado do colorante co que empezou.

Tres hábitos deste episodio que paga a pena conservar

1. "Primeiro fármaco sintético empregado en medicina" describe unha categoría, e os matices son maiores do que suxire a frase. A frase converteuse nunha expresión habitual; unha revisión moi citada de Schirmer e colaboradores en Neurobiology of Aging denomina o azul de metileno o primeiro fármaco plenamente sintético empregado en medicina. O hidrato de cloral introduciuse como sedante sintético en 1869, máis de vinte anos antes. O propio artigo de 1891 achega parte da resposta, porque os seus autores nomean os antipiréticos sintéticos que xa fracasaran contra a malaria, entre eles a quinolina, a antipirina e a antifebrina. O propio composto arsenical de Ehrlich para a sífilis chegou aínda máis tarde. A versión defendible da afirmación refírese ao método e non á prioridade: o azul de metileno está entre os primeiros compostos sintéticos escollidos para actuar contra un organismo específico sobre a base dunha teoría química da selectividade.
2. A distribución selectiva non é un beneficio selectivo. O resultado de Ehrlich en 1886 foi que o colorante chega ao tecido nervioso. Onde vai un composto e que fai ao chegar son dúas medicións diferentes, e a primeira é moito máis doada de realizar. Nesa fenda asentáronse desde entón a maioría das afirmacións sobre o azul de metileno e o cerebro.
3. A pureza forma parte das probas, non do márketing. O rexistro histórico é ambiguo precisamente por esta razón. Pequenas diferenzas estruturais cambian o destino deste composto, polo que un certificado de análise ten que estar vinculado a un lote específico en vez de ofrecerse como unha declaración de que un produto está analizado. Un vendedor que afirma a conformidade coa monografía da farmacopea mentres só analiza metais pesados está afirmando máis do que apoia o informe. Blupreme obtén azul de metileno dun fabricante farmacéutico e comproba a especificación completa que establece a monografía: identidade, pureza, impurezas orgánicas, disolventes residuais, impurezas elementais, residuo de ignición, límites microbianos e endotoxinas bacterianas. O informe publícase xunto co produto, e a páxina sobre o azul de metileno de grao USP explica eses límites e por que o resultado de azure B é o primeiro que cómpre buscar.

Un percorrido cronolóxico polas fontes

A secuencia cronolóxica dos fitos, incluída a química dos colorantes que precedeu a Ehrlich e os graos e especificacións que chegaron despois del, exponse por separado en a historia do azul de metileno, e a identidade do propio composto trátase en que é o azul de metileno.

As láminas que sustentan este relato, reproducidas na revisión de 2012 de Krafts, Hempelmann e Skórska-Stania, non son equivalentes, e un exemplo mostra por que. A lámina de 1891 é o rexistro primario do ensaio; o retrato de 1910 que aparece ao seu lado só sitúa no tempo unha reputación. As páxinas do caderno de Andersag de 1934 son o testemuño directo da substitución por quinolina, da propia man do químico.

O resumo honesto dos experimentos de Ehrlich cos colorantes é que acertou coa selectividade e coa diana, pero errou co mecanismo. O azul de metileno si se concentra no tecido nervioso e si dana o parasito da malaria. Non fai o segundo por mor do primeiro, e a razón química que ofreceu para ambos era errónea. O que demostrou sen lugar a dúbidas foi máis duradeiro ca un mecanismo correcto: un composto pode escollerse en vez de atoparse, e escollerse sobre a base de probas recollidas antes de que ninguén llo administre a un paciente.