Por que a absorción do azul de metileno cambia coa concentración

Colle unha botella de solución nai de azul de metileno e enche dous vasos. Enche o primeiro coa solución nai e o segundo cunha dilución de dez veces. O segundo vaso é máis pálido, como cabía esperar. Mira con atención e verás que tamén cambiou outra cousa. A tonalidade desprazouse. Unha solución tende a un azul celeste límpido e a outra a un azul con matiz violeta. A dilución fixo algo máis que reducir a intensidade. Cambiou a especie química responsable da maior parte da absorción.

O concepto que explica este cambio é sinxelo. O azul de metileno disolto non é unha única especie. O catión individual do colorante, chamado monómero, pode apilarse cara a cara cun segundo catión para formar un dímero, e os dímeros poden dar lugar a agregados máis grandes. Cada forma ten o seu propio espectro de absorción. O que rexistra un espectrofotómetro é a suma das contribucións da mestura presente nesa cubeta, nesas condicións. Cambia a mestura e o espectro desprázase, mesmo cando o contido total de colorante segue unha proporción de dilución directa.

O monómero e o dímero absorben de maneira distinta

Imaxina o monómero como unha carta plana cunha carga positiva distribuída polo seu sistema de aneis. Dúas cartas así poden colocarse cara a cara. As cargas positivas repélense, pero as superficies aromáticas planas atráense mediante interaccións de apilamento, e a auga e os contraións que as rodean apantallan a repulsión. O resultado é un par unido con estados electrónicos compartidos. As súas transicións permitidas teñen unha enerxía maior que a transición do monómero, polo que a banda do dímero aparece a unha lonxitude de onda máis curta que a do monómero; os agregados máis grandes contribúen máis cara ao lado azul en forma de ombreiro espectral.

A concentracións moi baixas en auga limpa, predominan os monómeros e domina a banda de lonxitude de onda longa. Ao aumentar a concentración total, a forma emparellada representa unha proporción cada vez maior e a banda de lonxitude de onda máis curta medra respecto da primeira. A relación entre as dúas bandas indica, polo tanto, a composición da mestura, non directamente a concentración total. Unha lectura nunha única lonxitude de onda non pode distinguir as dúas sen asumir que forma está presente.

Por iso os espectros de referencia deben ir sempre acompañados das condicións. A referencia espectral do azul de metileno recolle en táboas as posicións das bandas xunto co disolvente, o contido de sal do medio, o pH, a temperatura e o intervalo de concentración que as produciron. Se citas un pico sen esas condicións, o número queda insuficientemente definido. Dous laboratorios poden ter razón ao describir espectros distintos do mesmo colorante porque mediron mesturas distintas.

Que despraza o equilibrio

A concentración é o principal factor. A formación dun dímero require que se encontren dous monómeros, polo que a súa proporción aumenta máis rápido que de maneira lineal co colorante total. As constantes de dimerización publicadas para medios acuosos están na orde dos miles por molar preto da temperatura ambiente, de modo que a proporción de dímero aumenta pronunciadamente no intervalo micromolar. Un axuste global amplo que abranguía concentracións de colorante desde micromolares ata milimolares atopou unha contribución non nula do tetrámero xa por debaixo de 34 micromolar, o que advirte de que non se debe confiar nun axuste estrito de dúas especies a decenas de micromolar. As fraccións exactas dependen do medio, por iso este artigo indica tendencias en lugar dunha táboa de conversión universal.

O sal é o segundo factor. Os ións disoltos apantallan a repulsión entre dous catións, polo que engadir cloruro de sodio e electrólitos similares despraza a mestura cara aos dímeros e aos agregados coa mesma concentración de colorante. Este efecto é visible nos estudos da agregación do azul de metileno en medios salinos e acuosos, nos que se mediu colorante desde aproximadamente 1 micromolar ata 3.4 milimolar, con concentracións de cloruro de sodio de 0 a 0.15 molar. Nese axuste, a fracción de tetrámero alcanzou aproximadamente 0.93 no extremo de concentracións altas tanto de colorante como de sal. Un espectro rexistrado en auga e outro rexistrado en solución salina fisiolóxica non son, polo tanto, patróns intercambiables.

A temperatura actúa en sentido contrario. O apilamento libera auga ligada e o movemento térmico oponse a el, polo que quentar unha solución adoita disociar algúns dímeros de novo en monómeros, mentres que arrefriala favorece a asociación. A entalpía de disociación obtida no axuste é negativa, duns menos 30 quiloxulios por mol entre 282 e 333 kelvin, o que confirma unha asociación exotérmica. Unha mostra fría medida inmediatamente despois de sacala da neveira pode parecer máis agregada que a mesma mostra medida despois de equilibrarse á temperatura ambiente.

O disolvente establece o punto de partida. A auga, co seu forte efecto hidrófobo, favorece o apilamento dos catións planos do colorante. Os alcohois como o etanol e o metanol solvatan mellor os aneis e desfán os agregados, polo que unha mesma concentración de colorante presenta un carácter máis monomérico en etanol que en auga. Os codisolventes apróticos fan o mesmo: en mesturas de auga e DMSO a 293 kelvin, engadir DMSO suprimiu a dimerización, o que apunta á estrutura da auga como impulsora do apilamento. Cos tensioactivos hai que ter coidado en ambos os sentidos. Por riba da súa concentración micelar crítica, as micelas poden solubilizar os monómeros individualmente e restablecer un espectro semellante ao do monómero. Por debaixo dese punto, un tensioactivo de carga oposta pode, pola contra, favorecer o apilamento: con colorante a 100 micromolar, a polimerización inducida polo SDS alcanzou o seu máximo preto de 4 milimolar de SDS, aproximadamente a metade da concentración de formación de micelas, antes de que se producise unha redistribución a concentracións máis altas de tensioactivo. Os traballos sobre os efectos do disolvente e dos medios organizados nos espectros do azul de metileno ilustran ata que punto a contorna molecular inmediata, e non só a concentración global, determina as bandas observadas.

O pH importa principalmente nos extremos. No intervalo próximo á neutralidade empregado na maior parte do traballo de laboratorio, o azul de metileno mantén a súa coñecida forma catiónica azul, e a agregación domina o comportamento espectral. Un ácido ou unha base forte, a química redox que produce a forma leuco incolora ou a unión a proteínas e partículas engaden, cada un deles, estados máis alá do par monómero-dímero. Cando un espectro cambia despois de engadir unha solución tampón, comproba se a composición do tampón inclúe sal e compoñentes de unión antes de atribuílo todo só ao pH. A referencia sobre química e protonación mantén estas cuestións de identidade separadas da cuestión da agregación tratada aquí.

Por que se curva a recta de Beer-Lambert

A relación de Beer-Lambert di que a absorbancia é igual á absortividade multiplicada pola concentración e pola lonxitude do camiño óptico. É unha lei de reconto. Asume que os obxectos contados permanecen idénticos cando cambia o seu número: unha única especie absorbente, un espectro fixo, ningunha reacción química coa concentración, luz de medida monocromática, ausencia de dispersión ou reemisión e luz que percorre realmente o camiño indicado.

A agregación incumpre o primeiro suposto. Formalmente, a absorbancia total segue sendo unha suma das contribucións das especies: a lonxitude do camiño óptico multiplicada por cada absortividade e pola concentración da especie correspondente. Cada especie cumpre a lei. A mestura non, porque as concentracións das especies son funcións non lineais do colorante total. Unha curva de calibración da absorbancia na banda do monómero fronte ao colorante total comeza, polo tanto, como unha recta no límite diluído e cúrvase cara abaixo a medida que aumenta a concentración, porque cada incremento engadido achega proporcionalmente menos monómero. Unha curva lida na banda do dímero cúrvase no sentido contrario. Os traballos sobre agregación sinalan precisamente este mecanismo como a orixe das desviacións de Lambert-Beer observadas. Axustar unha recta na rexión curvada e extrapolala é o erro habitual. A recta só é válida dentro do intervalo e da matriz nos que se construíu.

A dilución crea unha trampa relacionada. Diluír unha solución nai concentrada para entrar no intervalo do instrumento non conserva a proporción entre especies. A solución diluída da cubeta volve equilibrarse cara ao monómero, polo que o seu espectro describe correctamente a mostra diluída, pero non a solución nai. Calcular retrospectivamente o espectro da solución nai aumentando proporcionalmente as absorbancias só recupera a estimación do contido total se a calibración xa ten en conta o desprazamento. Nunca recupera a forma orixinal das bandas. Quen compara o espectro dun concentrado cunha referencia diluída está a comparar dúas mesturas distintas.

A lonxitude do camiño óptico forma parte do resultado

A absorbancia aumenta proporcionalmente coa distancia que percorre a luz a través da mostra. Unha cubeta de 10 mm dá dez veces a absorbancia dunha cubeta de 1 mm que contén a mesma solución. Esa proporcionalidade só é exacta para a mesma solución, e a agregación fai que esa condición sexa esencial.

Na práctica, a lonxitude do camiño óptico é unha ferramenta para manterse dentro do intervalo válido. Un camiño longo proporciona sensibilidade para solucións diluídas, maioritariamente monoméricas. Un camiño curto mantén unha mostra concentrada dentro da escala sen unha gran dilución que restablecería o equilibrio. O programa de estudo da agregación do que proceden os números anteriores fixo exactamente isto: cubetas de 1 centímetro para colorante entre 1.1 e 34 micromolar, e cubetas de 0.01 centímetros para entre 94 micromolar e 3.4 milimolar. Os pedestais de microvolume e os lectores de placas engaden a súa propia xeometría, con camiños curtos e ás veces variables, ademais de superficies nas que o colorante catiónico pode adsorberse. Indica o camiño óptico xunto co número, do mesmo xeito que a referencia espectral indica o disolvente e o sal. Unha absorbancia sen lonxitude do camiño óptico non é un resultado. É un rumor.

O rigor na medición deriva do mecanismo. Equilibra as mostras a unha mesma temperatura antes da lectura. Emprega o mesmo tipo e orientación de cubeta, brancos correspondentes que conteñan o mesmo sal e tampón do medio, e material de vidro limpo, porque o azul de metileno se adsorbe ao vidro e ao plástico, e unha cubeta tinguida conserva unha memoria da última mostra concentrada. Fai a lectura pouco despois da preparación cando importe a cinética de agregación, e constrúe cada curva de calibración na mesma matriz e coa mesma lonxitude do camiño óptico que as mostras de concentración descoñecida. Para as comprobacións visuais, lembra que o ollo é un mal espectrómetro. Se a cor dunha solución pode determinar a súa pureza é unha cuestión distinta cunha resposta negativa, e os cambios de tonalidade debidos á agregación son unha das razóns.

Un diagrama para ter ao lado do instrumento

A figura seguinte resume o artigo nunha única referencia para a bancada de laboratorio. Tres solucións comparten o mesmo colorante, pero difiren na concentración total e no contido de sal do medio. Os seus espectros esquemáticos mostran como a banda do monómero de lonxitude de onda longa perde peso fronte á banda do dímero de lonxitude de onda máis curta a medida que aumenta o apilamento. As condicións están impresas na figura porque, sen elas, as curvas non se poden reutilizar. Para consultar posicións de bandas medidas baixo condicións especificadas, utiliza a referencia espectral. Para saber como entra o colorante nas células unha vez en solución, consulta a entrada nas células mediante redución e partición. Para saber como a dose de luz e a xeometría modifican aínda máis os resultados das medicións fotoquímicas, consulta a exposición á luz e a xeometría de medición.

A regra que convén lembrar ten dúas partes. O espectro identifica a mestura presente na cubeta baixo as condicións indicadas. Só unha calibración construída baixo esas mesmas condicións converte unha absorbancia nunha concentración total.