Pode o azul de metileno sortear o complexo III mitocondrial? Por que discrepan os estudos

Dous laboratorios preguntáronse se o azul de metileno pode sortear un complexo III mitocondrial bloqueado. Un respondeu que non. O outro respondeu que si. Ambos tiñan datos.

O primeiro estudo, con mitocondrias do cerebro de rato, concluíu que o colorante non pode facelo. O segundo, con mitocondrias cerebrais de tres especies de roedores, concluíu que pode facelo parcialmente. Un terceiro estudo, con fígado de rato, adoita citarse neste contexto, pero examinou outra cousa. Se se sitúa no seu lugar, desaparece a metade da confusión.

Non hai un mecanismo universal que anunciar. Hai tres experimentos con distintos bloqueadores, doses e medicións. Lea primeiro as condicións. As conclusións veñen despois.

Que significa aquí unha vía alternativa

Os electróns entran na cadea polo complexo I (desde o NADH) ou polo complexo II (desde o succinato), pasan polo complexo III ata o citocromo c e despois polo complexo IV ata o osíxeno. O gradiente que se xera polo camiño é o que a célula utiliza para producir ATP.

A afirmación de que existe unha vía alternativa implica que o azul de metileno recolle electróns antes dun bloqueo e os entrega despois del. O colorante oxidado acepta electróns do NADH ou dos compoñentes iniciais da cadea, converténdose en leucoazul de metileno, e a forma reducida entrégaos ao citocromo c ou devólveos á cadea. Se a transferencia se produce despois do bloqueo, a respiración e o potencial de membrana recupéranse parcialmente. Se se produce no punto de bloqueo ou antes del, non se recupera nada.

Un detalle do complexo III determina boa parte desta controversia. O complexo funciona mediante un ciclo Q con dous sitios de unión para inhibidores. A antimicina únese ao sitio Qi. O mixotiazol únese ao sitio Qo. Un estudo que empregue só un deles examinou unicamente a metade do complexo.

Primeiro estudo: sen vía alternativa nas mitocondrias do cerebro de rato

Gureev e os seus colaboradores empregaron mitocondrias da cortiza cerebral de ratos C57BL/6, illadas con dixitonina e analizadas a 0.1 mg de proteína por ml. Os substratos abranguían tres condicións: piruvato máis malato a 5 mM cada un, succinato a 10 mM con glutamato a 2 mM e L-prolina a 10 mM. Os bloqueadores foron rotenona a 1 micromolar (complexo I) e antimicina a 1 microgramo por ml (complexo III). As doses de colorante foron de 0.5, 1 e 2 micromolar, con 1 micromolar como concentración principal. Os métodos e os rexistros están na comunicación de FEBS Letters.

A vía alternativa ao complexo I funcionou. A rotenona reduciu a respiración estimulada por ADP duns 121 a uns 2 nmol por minuto por mg, e o colorante a 1 micromolar recuperouna ata uns 21. O potencial de membrana recuperouse con piruvato máis malato e con L-prolina.

A vía alternativa ao complexo III non funcionou. A antimicina reduciu a respiración ata uns 16, e o colorante só a elevou ata uns 20. O potencial de membrana non se recuperou con ningún substrato, a doses de colorante de ata 5 micromolar. Os datos de peróxido apuntaban na mesma dirección: o colorante por si só elevou a emisión de peróxido desde unha taxa basal próxima a 76 pmol por minuto por mg ata aproximadamente 1170, 1460 e 1945 nas tres doses, pero a antimicina reduciu ese sinal xerado polo colorante nun 25, 88 e 96 por cento, respectivamente. Se o colorante reducido reaccionase directamente co osíxeno, bloquear o complexo III non debería suprimir o sinal. Os autores deduciron que o colorante reducido se oxida no sitio Qo do complexo III, antes do bloqueo pola antimicina. O circuíto curto, en palabras: dos doadores ao colorante, do colorante a Qo e continuación pola ruta normal. A rotenona sortéase. A antimicina non.

Segundo estudo: vía alternativa parcial en tres especies, nos dous sitios de unión para inhibidores

Svab e os seus colaboradores ampliaron o deseño. Empregaron mitocondrias cerebrais de ratos, ratas e cobaias, illadas con Percoll e analizadas á mesma concentración de 0.1 mg por ml, con piruvato máis malato ou glutamato máis malato a 5 mM cada un. Utilizaron dous bloqueadores do complexo III: antimicina A a 0.3 micromolar e mixotiazol a 1 micromolar. O colorante estaba a 2 micromolar na maioría dos ensaios e a 0.5 no traballo co citocromo c. As tres especies, con protocolos equivalentes, figuran no artigo de acceso aberto.

Ambos os bloqueos sorteáronse parcialmente nas tres especies. Nas mitocondrias de rato, a antimicina suprimiu a respiración e o colorante elevouna arredor dun 60 por cento, de aproximadamente 37 a 59 nmol por minuto por mg. O mixotiazol suprimiuna nun 88 por cento, ata uns 4.5, e o colorante quintuplicouna ata uns 23. O potencial de membrana repolarizouse parcialmente con calquera dos inhibidores, medido con dous colorantes (safranina O e TMRM ratiométrico) para descartar artefactos ópticos.

Este artigo tamén examinou directamente a transferencia, algo que o primeiro estudo nunca fixera. As mitocondrias enerxizadas non reduciron o citocromo c acetilado exóxeno a 25 micromolar, con ou sen inhibidores, pero a adición do colorante impulsou a redución en ambos os casos. Nun tampón sen células, o NADH máis o colorante reduciron o citocromo c a unha velocidade proporcional ao NADH. O salto máis longo, en palabras: dos equivalentes redutores ao colorante, do colorante directamente ao citocromo c e do complexo IV ao osíxeno. Esa ruta evita por completo o complexo III, polo que se poden sortear ambos os bloqueadores.

Dúas medicións adicionais apoian esa interpretación. A fluorescencia do NAD(P)H diminuíu ao engadir o colorante ás mitocondrias tratadas con mixotiazol, o que indica que os equivalentes redutores se consumían pola nova ruta. Ademais, a absorbancia do colorante a 660 nm reflectiu sucesivamente cada adición, mentres que os sobrenadantes obtidos por centrifugación amosaron unha acumulación do colorante oxidado de máis de cen veces no interior das mitocondrias enerxizadas, seguida da súa saída cando colapsaba o potencial. O balance de protóns tamén encaixa: evitar as etapas de bombeo deixa aproximadamente 2 protóns por par de electróns en lugar de 10, polo que un consumo de osíxeno máis rápido con só unha repolarización parcial é o que cabe esperar dunha vía alternativa real, non unha proba na súa contra.

A mesma preparación produciu respostas que penalizan unha lectura superficial. Co inhibidor máis o colorante, o ADP reduciu a respiración en vez de aumentala, e o bloqueo do transporte estimulouna en vez de retardala, mentres que o potencial de membrana seguía cambiando nas direccións habituais. O consumo de osíxeno por si só resulta enganoso neste sistema.

Terceiro estudo: o estudo hepático que examinou os complexos I e II, non o III

Lee e Boelsterli empregaron mitocondrias do fígado de rato e hepatocitos en cultivo danados por efavirenz (complexo I, IC50 próxima a 30 micromolar) e por hidrazina, o metabolito da isoniazida (complexo II, IC50 próxima a 30 micromolar). O colorante a uns 30 micromolar restableceu a oxidación do NADH, o potencial de membrana e o ATP, ao tempo que reduciu os oxidantes e a morte por necrose. O artigo de Redox Biology preséntao mediante un modelo no que o colorante transporta electróns sorteando os complexos I e II danados.

Ese resultado constitúe un contexto establecido para os pasos anteriores da cadea, e non di nada sobre o complexo III porque nel non se bloqueou nada nese punto. Non pode confirmar nin refutar ningún dos dous estudos cerebrais.

A matriz de condicións

Catro razóns polas que ambos os estudos do complexo III poden ter razón nas súas propias condicións

1. O bloqueo non foi a mesma intervención. Antimicina soa a 1 microgramo por ml fronte a antimicina a 0.3 micromolar máis un bloqueador independente do sitio Qo. Unha ruta do colorante que entrega electróns ao sitio Qo falla precisamente onde funciona unha ruta directa ao citocromo c. Un sitio non pode representar os dous.

2. A dose de colorante e os tempos foron diferentes. Concentracións principais de 1 fronte a 2 micromolar, nun composto que participa en ciclos redox e cuxa captación e redución directa do citocromo c dependen da concentración e do tempo. Pequenas diferenzas de dose, xunto con distintos momentos de medición, poden poñer de manifesto distintas ramas dunha mesma rede.

3. As preparacións foron diferentes. O illamento con dixitonina fronte ao illamento en gradiente de Percoll selecciona poboacións mitocondriais que se solapan, pero non son idénticas. A concentración de proteína coincidía en 0.1 mg por ml, polo que esa variable queda descartada, pero non a subpoboación nin a integridade. E descartouse a especie como sospeitosa: o segundo grupo reproduciu o seu fenotipo tamén no rato.

4. O estado dos substratos determina o que pode facer o colorante. Tres condicións de substratos fronte a pares asociados ao NADH. A dispoñibilidade de NADH e o potencial de membrana determinan conxuntamente a rapidez coa que se reduce o colorante e como se distribúe; unha ruta que require colorante reducido xunto a citocromo c oxidado depende desa elección.

Como ler a próxima afirmación sobre unha vía alternativa

Pregunte que complexo se bloqueou, con que inhibidor, en que sitio e a que dose. Pregunte a concentración do colorante e cando se fixo a medición. Pregunte o tecido, a especie, o método de illamento, a concentración de proteína e o substrato. E pregunte se concordan o potencial, a respiración, o estado redox e un ensaio de transferencia directa, porque aquí o consumo de osíxeno por si só apuntou na dirección equivocada máis dunha vez.

O resumo limitado mantense. Hai acordo sobre a vía alternativa do colorante que sortea o complexo I. No caso do complexo III, as mitocondrias de rato con antimicina a 1 microgramo por ml e colorante a 1 micromolar non amosan unha vía alternativa funcional, mentres que tres especies con antimicina a 0.3 micromolar ou mixotiazol a 1 micromolar e colorante a 2 micromolar amosan unha vía alternativa parcial con transferencia directa do colorante ao citocromo c. Esas afirmacións poden coexistir. Calquera conclusión máis ampla é unha extrapolación.

As lecturas relacionadas sitúan a afirmación discutida dentro da química non controvertida: como o azul de metileno transporta electróns para a transferencia, os experimentos sobre a vía alternativa ao complexo I para o caso establecido nos pasos anteriores da cadea, as medicións do potencial de membrana e os seus artefactos para entender por que se precisaron dous colorantes, e o manexo no laboratorio dos compostos que participan en ciclos redox para as trampas das doses e dos tempos.